人参地微杆菌S4的发酵条件优化及其盐碱胁迫下对水稻幼苗的促生作用

齐玉玺,张琇*,杨国平,3,朱娟娟,沈婷婷,季鸿飞,吴凯华

人参地微杆菌S4的发酵条件优化及其盐碱胁迫下对水稻幼苗的促生作用

齐玉玺1,2,张琇1,2*,杨国平1,2,3,朱娟娟1,沈婷婷1,2,季鸿飞1,2,吴凯华1,2

1. 北方民族大学生物科学与工程学院, 宁夏 银川 750021 2. 宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室, 宁夏 银川 750021 3. 宁夏五丰农业科技有限公司, 宁夏 银川 750021

自然界存在着可促进作物耐盐碱的菌株，为获得可提高水稻适应于盐碱地种植的生物菌剂，本研究以人参地微杆菌S4（S4）为对象，采用摇瓶发酵优化的方式，设计单因素与正交实验，研究碳源、氮源、无机盐组分及pH、温度、转速、接种量对S4发酵的影响；将发酵优化后条件在5 L发酵罐中进行小试试验；测定水培14 d后不同处理下水稻幼苗的生理指标。实验结果表明，该菌株最适生长培养基为蔗糖0.7%、酵母浸出粉1.2%、MgSO40.2%，最适起始pH值为8，最适生长温度为24 ℃，最佳接种量为5%，最佳转速为220 r/min。小试发酵优化后比优化前菌体生长量提高了7.09倍。S4菌液浸种后对盐碱胁迫下的水稻有明显的促生作用，株高、鲜重及SOD、CAT、POD、Pro显著提高，而MDA含量显著降低。研究结果可为S4菌的规模化生产和应用奠定基础。

人参地微杆菌; 发酵优化; 水稻; 促生作用

土壤盐渍化是一个全球性的环境问题，盐碱土的年增长率约为1.0×106～1.5×106hm2[1]。土壤盐渍化会抑制植物的光合作用、影响相关酶活性及代谢途径使作物产量减少[2-4]。目前，我国盐碱地所占面积约为3.6×107hm2，占我国耕地总面积的4.88%[5]，盐碱地利用极其困难，合理开发利用盐碱地，对于提高我国农业生产力具有重要意义[6,7]。

中国是世界最大的水稻生产国和消费国[8]。水稻是可以种植在盐碱地的先锋作物，但是在盐碱地生长会降低水稻产量和品质[9,10]。许多研究表明，促进植物生长的根际细菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）可以诱导植物建立抗盐碱或耐盐碱机制，提高植物在盐碱胁迫下的生存能力[2,3]。PGPR已成为土壤微生物学研究的热点，也是生态学和植物抗逆性研究的热点之一[11]，但促进水稻耐盐碱的菌源较少，有关水稻耐盐碱促生菌的发酵优化及其性能鉴定研究鲜有报道。

本研究将人参地微杆菌S4菌进行发酵条件优化，并在5 L自动发酵罐中进行小试试验验证，初步研究S4菌浸种后对盐碱胁迫下水稻的促生效应，旨在为盐碱地改良提供优良菌源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 人参地微杆菌（）S4保藏于宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室。

水稻种子：品种宁粳51号。

1.1.2 基础培养基 蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，牛肉膏3.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2[12]。

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2。

植物营养液：常规植物营养液为1000 mL蒸馏水中加入各种母液1 mL，高压灭菌20 min；盐碱胁迫营养液为常规植物营养液加200 mmol NaCl，用饱和Na2CO3溶液调至pH 8.5。苏州科铭生物技术有限公司试剂盒。

1.2 主要仪器

TGL-20M高速冷冻离心机；UV-1000天美紫外可见分光光度计；JLRX-800B-FB植物培养箱；MRS-9600TFU2L根系扫描仪；G-9S双光束扫描型紫外分光光度计。

1.3 实验方法

1.3.1 菌体生长测定 通过全波长扫描确定菌体最大吸光度，将待测发酵液离心后弃上清加入等体积蒸馏水，蒸馏水调零，测定吸光度，分析菌体生长情况，通过平板计数法测定菌数[13,14]。

1.3.2 母液配制 将保存在平板的菌株活化后，将其置于LB培养基中，生长条件为37 ℃、200 r/min，培养周期18 h，置于4 ℃冰箱，备用。

1.3.3 单因素培养基优化实验 培养基pH值为7.2，接种量为3%，在30 ℃和200 r/min培养18 h。碳源：添加0.3%的牛肉膏、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、木糖，空白对照（无碳源）[15]，将菌悬液进行离心稀释后测定OD400时该菌的吸光度，选出最适碳源后，按照0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%添加量，选出最佳碳源浓度；氮源：添加1%尿素、氯化铵、蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵，空白对照（无氮源）[16]，将菌悬液进行离心稀释后测定OD400时该菌的吸光度，得出最佳氮源，按照0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%添加量，选出最佳氮源浓度；无机盐：添加0.5%的NaCl、MgSO4、K2SO4、CoCl2、MnCl2，空白对照（不添加无机盐），将菌悬液进行离心稀释后测定OD400处该菌的吸光度，找出对菌生长效果最佳的无机盐后，按照0%、0.1%、0.2%添加量，选出最佳无机盐浓度。

1.3.4 培养基的正交实验在单因素实验的基础上，将该菌OD值作为判断依据。研究碳源、氮源及其无机盐对S4菌生长的作用。采取3因素3水平L9 (34)的正交实验得出最适合S4菌株生长培养基的组合。

1.3.5 生长条件优化单因素实验 以培养基优化为基础，研究接种量、培养温度、pH和转速对该菌生长的影响。

1.3.6 生长条件优化正交实验 以单因素实验为基础，研究了接种量、pH、培养温度、转速等因素对S4菌生长的影响。采用4因素3水平L9（34）进行正交实验。

1.3.7 小试发酵 用发酵罐培养进一步进行验证摇瓶优化结果，将正交优化所得最佳发酵培养条件和优化前的发酵培养条件进行5 L自动发酵罐小试试验，每隔3 h记录菌株的生长情况，将该菌株在优化前后的生长情况进行对比分析。优化前培养条件为基础培养基、温度30 ℃、pH为7.2，接种量3%。

1.3.8 水稻幼苗的生理指标测定 本次实验设置2个处理：盐碱对照组：无S4菌浸种，盐碱胁迫植物营养液；盐碱加菌浸种组：S4菌浸种，盐碱胁迫植物营养液（S4菌浸种方法为1×108cfu/mL菌悬液浸种）。将2个处理所需的种子在55 ℃水浴锅浸种15 min，用酒精去除表面张力10 s，0.1%升汞进行表面消毒30 s，无菌水清洗6次，消毒完成后对种子进行不同处理，将不同处理的种子摆放于水琼脂，待其发芽后移到灭菌的塑料瓶，塑料瓶中有300 g石子，60 mL不同处理的植物营养液，放入植物光照培养箱培养14 d后测定不同处理下水稻根长、株高，将样品液氮保存后存放于-80 ℃超低温冰箱备用，用苏州科铭试剂公司试剂盒测定水稻幼苗根部的超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、脯氨酸（Pro）、丙二醛(malondialdehyde，MDA)。

2 结果与分析

2.1 单因素培养基优化结果

2.1.1 碳源对菌株生长的影响 根据图1(a)可得，蔗糖最有利于菌体生长，空白组中菌株生长量最低，实验得出蔗糖为最适合其生长的碳源。(b)图表明，当蔗糖添加量为0.5%时，菌株的生长最好。

图1 最佳碳源及其浓度的确定

2.1.2 氮源对菌株生长情况的影响 图2 (a)表示在该菌株的生长期间，使用不同的氮源等量替换基础培养基的氮源，该菌的生长情况。酵母浸粉为氮源时明显优于其他氮源和空白组。图2（b）结果表明，当最适氮源酵母浸粉为培养基中氮源时，其氮源添加量对该菌生长的作用。其添加量1.2%时，菌株生长最好。

图2 最佳氮源及其浓度的确定

2.1.3 无机盐对菌株生长的影响 由图3可以看出，没有添加无机盐的培养基与添加MgSO4的培养基菌体生长情况好于加入NaCl、K2SO4、CoCl2、MnCl2的培养基。将MgSO4添加量0%、0.1%、0.2%作为正交实验的因素。

图3 最佳无机盐及其浓度的确定

2.2 最佳培养基的确定

以菌体OD值为生长指标，研究了碳源、氮源及无机盐对细菌生长的作用。采用三因素三水平L9（34）正交实验得到该菌培养基的最佳组合。正交实验因素水平如表1所显。

表1 L9(34)正交实验因素水平表

2.2.1 生长条件优化的正交实验结果 S4菌生长情况如表2所示。

表 2 L9(34 )正交实验设计及结果

由表2得出，极差值大小排序为A＞C＞B，故对S4菌体生长的影响因素蔗糖＞MgSO4＞酵母浸粉。通过图表分析，A3 B3 C3的实验组合为最佳方案。

2.2.2 培养基优化的验证实验 将正交优化所得到的最佳组合A3 B3 C3与实验过程中生长情况最好的组合A3 B1 C3进行3次重复实验，对正交结果进行验证，A3 B3 C3的菌浓度比A3 B1 C3提升了6×108cfu/mL。验证结果与正交实验结果相符合，故S4菌的最佳培养基配方为蔗糖0.7%，酵母浸粉1.2%，MgSO40.2%。

2.3 优化培养条件的单因素实验结果

2.3.1 pH值对S4菌生长的影响 以培养基正交优化得到的结果为基础，施加适量1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调至培养基pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10，接种体积3%，30 ℃，200 r/min，培养18 h，用UV光谱仪进行细菌计数。如图4所显，在酸性和碱性环境中，不利于菌体生长。当pH值为8时，菌体生长情况最佳。

图4 pH值S4菌生长的影响

2.3.2 S4菌在不同温度下的生长情况 由2.3.1所得，培养基的pH值为8，转速为200 r/min，放置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的摇床培养18 h，紫外分光光度法测菌体数量，生长情况如图5所显。通过分析图5得出，伴随培养条件温度升高，该菌数量增加，可是超过25 ℃温度后，该菌数量减少。培养条件25 ℃时，菌体生长情况最好。

图5 温度对S4菌生长的影响

2.3.3 不同转速对S4菌影响 以2.3.1和2.3.2的实验所得为基础，观察菌株在转速为120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min条件下的生长情况，紫外分光光度法测定菌OD值，生长情况见图6。由图6可以看出，转速设置为200 r/min时，菌株生长情况最好。

图6 转速对S4菌生长的影响

2.3.4 不同接种量对S4菌影响 以2.3.1、2.3.2和2.3.3的实验为基础，调至培养基pH值为8.0，摇床培养条件25 ℃，200 r/min，种子液按照接种量为2%、4%、6%、8%、10%和12%加入至优化完成后的培养基中，培养24 h。生长情况见图7。如图7所示，在某一范围下S4菌是伴随接种量的提高，生长量也随之提高。该菌株接种量4%时，菌株的生长量最高，接种量超过4%影响菌体生长。

图7 接种量对S4菌生长的影响

2.4 生长条件优化的正交实验 根据以上单因素实验数据所得，以该菌的OD值为评价指标，研究了接种量、pH值、转速和温度对S4菌株生长的影响。根据四因素三水平L9（34）正交实验研究，得到了菌株最佳培养条件。正交实验的因素水平和实验所得结果见表3和表4。

表3 L9(34 )正交实验因素水平表

表4 L9(34 )正交实验设计及结果

将正交优化所得到的最佳组合A1 B2 C3 D3与实验过程中生长情况最好的组合A1 B2 C3 D2 及初始发酵条件进行3次重复实验后进行结果验证，组合A1 B2 C3 D3的菌浓度达到3.7×109cfu/mL优于组合A1 B2 C3 D2，并相较于初始发酵条件下菌体浓度3.44×108cfu/mL提高了10.76倍。实验结果与正交实验推断相符合，得出S4菌生长的最佳发酵条件为pH值8，温度24 ℃，转速220 r/min，接种量5%。

2.5 生长曲线的测定

将菌株在最适条件进行培养，间隔3 h取样，离心后弃掉上清液，使用蒸馏水稀释，测定菌株在400 nm处的OD值，记录生长曲线。图8可见，培养9 h后进入对数生长期，21 h后进入稳定期，36 h后进入菌的衰亡期。

图8 菌株生长曲线

2.6 小试发酵试验

通过图9可看出，S4菌在优化后的培养条件中培养，菌体生长量明显高于在优化前培养条件中的生长量，利用5 L自动发酵罐进行试验，试验结果与摇瓶实验结果基本一致，较优化前菌体生长量提高了7.09倍，且在5 L发酵罐中培养的S4菌的生长量高于摇瓶发酵的生长量。

图9 5L自动发酵罐中优化前后条件下菌株的生长曲线

2.7 S4菌对盐碱胁迫下水稻幼苗的促生作用

测定S4菌浸种对盐碱条件下水稻生理指标的影响，由图10和表5可知：用S4菌浸种后盐碱胁迫下的水稻幼苗相较于盐碱对照处理有更好的生长表现，检验差异分析得出：除根长与POD没有得到显著变化，株高、鲜重、SOD、CAT、Pro、MDA均有显著性差异，盐碱＋加菌浸种组的株高、鲜重、SOD、CAT、Pro相较于盐碱对照组分别显著提升了36.05%、13.88%、23.07%、16.88%、33.26%，MDA含量显著下降了55.50%，表明该菌对水稻有明显的促生作用，可以显著提高水稻SOD、CAT、Pro含量，降低活性氧和过氧化氢过量引发的膜质破坏，调节渗透压，并减少有害物质如MDA等的积累，增强水稻的抗氧化能力。

图10 盐碱＋加菌浸种后水稻幼苗生长情况与盐碱对照对比

表5 菌浸种对盐碱胁迫下水稻幼苗的影响

3 讨论

早在19世纪末期，根瘤菌就应用于农业生产。植物促生菌能够提高作物产量，施用植物促生菌剂成为解决当前农业生产问题最有效手段之一，但是促生菌菌源稀缺，能够提高耐盐、碱作用的菌株更是稀缺。目前，已发现的PGPR大多数属于芽孢杆菌属、假单胞菌属[17,18]等，但人参地微杆菌作为植物促生菌的研究尚属少见。袁东等[19]研究表明在盐胁迫下加植物促生菌可以增加水稻幼苗的根长、株高、鲜重，提高SOD、POD、CAT酶的活性，清除过量的活性氧带来的损伤；显著提高了用于判定植物抗逆能力与受损程度的Pro含量，显著降低决定膜损伤程度的MDA含量，与本研究盐碱胁迫下加入S4菌水稻生理指标变化结果相似。大部分植物促生菌研究目前还停留在实验室阶段，未能将促生菌进行规模化发酵，应用于田间试验，本研究对人参地微杆菌S4进行发酵优化为后续进行的大田实验和促生菌菌剂生产提供理论依据[20,21]。

4 结论

（1）S4菌株最适生长培养基为蔗糖7.0 g/L、酵母浸出粉12 .0 g/L、MgSO42.0 g/L；最适培养条件为pH 8.0，温度24 ℃，转速220 r/min，接种量5%；培养9 h达到对数期，在生长18 h菌株活力旺盛；正交优化条件可用于5 L发酵罐中进行小试发酵，菌体产量较高；

（2）水培实验显示用S4菌株浸种后水稻幼苗在盐碱条件下的根长、株高、鲜重、SOD、POD、CAT、Pro均高于对照组，MDA含量低于对照组，盐碱＋加菌浸种组的株高、鲜重、SOD、CAT、Pro相较于对照组，分别显著提高36.05%、13.88%、23.07%、16.88%、33.26%，MDA含量显著降低55.50%。

[1] Godfray HC, Beddington JR, Crute IR,. Food security：the challenge of feeding 9 billion people [J]. Science, 2010,327(5967):812-818

[2] 井大炜,马海林,刘方春,等.盐胁迫环境下接种根际促生细菌对白蜡树根际生物学特征及其生长的影响[J].水土保 持通报,2018,38(1):76-81

[3] Vimal SR, Singh JS, Arora NK,. Soil-plant-microbe interactions in stressed agriculture management:A review [J]. Pedosphere, 2017,27(2):177-192

[4] 李建国,濮励杰,朱明,等.土壤盐渍化研究现状及未来研究热点[J].地理学报,2012,67(9):1233-1245

[5] 王佳丽,黄贤金,钟太洋,等.盐碱地可持续利用研究综述[J].地理学报,2011,66(5):673-684

[6] 杨劲松,姚荣江,王相平,等.中国盐渍土研究:历程、现状与展望[J].土壤学报,2022,59(1):10-27

[7] 赵明范.世界土壤盐渍化现状及研究趋势[J].世界林业研究,1994(1):84-86

[8] 郭韬,余泓,邱杰,等.中国水稻遗传学研究进展与分子设计育种[J].中国科学:生命科学,2019,49(10):1185-1212

[9] 丁俊杰,刘凯,姚亮亮,等.微生物菌剂及硅肥对盐碱地水稻生长发育及土壤环境的影响[J].中国稻米,2022,28(1):63-66

[10] 杨淑华,巩志忠,郭岩,等.中国植物应答环境变化研究的过去与未来[J].中国科学:生命科学,2019,49(11):1457-1478

[11] 穆文强,康慎敏,李平兰.根际促生菌对植物的生长促进作用及机制研究进展[J].生命科学,2022,34(2):118-127

[12] 叶碧霞,左勇,傅彬,等.一种枯草芽孢杆菌培养基及培养条件的优化[J].食品科技,2017,42(1):23-28

[13] 沈萍,陈向东.微生物学实验[M].北京:高等教育出版社,2007:28-34

[14] 张琇,林勤.红酵母NZ-01发酵条件的优化[J].生物技术通报,2010(4):198-202

[15] 杨晓蕾,李建宏,姚拓,等.复合促生菌剂发酵条件优化及其对青稞促生效果评价[J].草地学报,2022,30(1):212-219

[16] 董京萍,陈羽,张顺琦,等.枯草芽孢杆菌B731发酵工艺优化[J].扬州大学学报(农业与生命科学版),2016,37(2):87-92

[17] 王洋,张瑞,刘永昊,等.水稻对盐胁迫的响应及耐盐机理研究进展[J].中国水稻科学,2022,36(2):105-117

[18] 邢起铭,金文杰,周利斌,等.植物根际促生菌提高植物耐盐性的研究进展[J].中国农学通报,2022,38(11):46-52

[19] 袁东.植物促生菌的分离及盐胁迫下对水稻生长的影响[D].天津:天津大学,2019

[20] 袁辉林,蔡尚,吕烈武,等.植物促生菌培养条件优化及其对尾叶桉幼苗接种效应的研究[J].热带作物学报,2013,34 (10):1888-1894

[21] 李壮,吴凯华,齐玉玺,等.促进水稻耐盐碱细菌S4菌株的筛选鉴定及其效果研究[J].西北农业学报,2022,31(8):1-9

Optimization of Fermentation Conditions of Strain S4 and Its Growth-promoting Effect on Rice Seedlings under Saline Alkali Stress

QI Yu-xi1,2, ZHANG Xiu1,2, YANG Guo-ping1,2,3, ZHU Juan-juan1, SHEN Ting-ting1,2, JI Hong-fei1,2, WU Kai-hua1,2

1.750021,2750021,3750021,

There are strains that can promote the salt tolerance of crops in nature. In order to obtain biological agents that can improve the adaptability of rice to plant in saline alkali land,S4 was selected to study in this paper.The carbon source, nitrogen source, inorganic salt components in culture media of strain S4 and pH, temperature, rotating speed, inoculation amount etc were optimized by shaking flask with single factor and orthogonal experiment. The conditions after fermentation optimization were tested in a 5 L fermentor; The physiological indexes of rice seedlings under different treatments after 14 days of hydroponic culture were measured. The results indicated that the optimum growth medium of strain S4 was sucrose 0.7 %, yeast extract powder 1.2 %, MgSO40.2 %, the optimum initial pH was 8, the optimum growth temperature was 24 ℃, the optimum inoculation amount was 5%, and the optimum rotation speed was 220 r/min. The cell quantity after fermentation optimization was 7.09 times higher than that before fermentation optimization. After soaking seeds in the bacterial suspension of strain S4, it can significantly promote the growth of rice under salt and alkali stress. The height, fresh weight of rice seedlings and the activities of SOD, CAT, POD and Pro in rice seedlings increased significantly, while the content of MDA in rice seedlings decreased remarkably. The results could lay a foundation for the large-scale culture and application of strain S4.

; fermentation optimization; rice; growth-promoting effect

Q815

A

1000-2324(2022)05-0719-09

2022-04-14

2022-05-20

国家自然科学基金(32060424);宁夏银川市科技创新项目(2022NY04);国家民委中青年英才计划项目(2016)

齐玉玺(1998-),男,在读研究生,研究方向:微生物生态学. E-mail:2665711327@qq.com

通讯作者:Author for correspondence.E-mail:zhangxiu101@aliyun.com