改进的QuEChERS-UPLCMSMS测定姜中32种氨基甲酸酯类农药

唐翩翩，支红峰*，朱玉真

永康市食品药品检验检测中心（永康 321300）

氨基甲酸酯类农药是三大农药种类之一，随着诸多剧毒有机磷和有机氯农药的逐步禁用，氨基甲酸酯类农药在蔬菜上的应用占比越来越高[1]，虽然杀虫效果显著，但是有急性毒性作用，在农产品中的残留会对人畜危害严重[2-3]。其前处理方式主要包括：固相萃取、在线固相萃取、基质固相分散萃取、凝胶渗透色谱、加速溶剂萃取和QuEChERS法[4-5]等。其中QuEChERS法有着明显的效率和经济方法的优势。但是它净化效果相对不好，基质效应强。目前关于QuECh-ERS法基质效应的研究较多，但是对于消除基质效应的研究较少[6]。应用QuEChERS检测果蔬农残的国家安全标准和文献，定量方式均为基质标定量。文章计划优化方法条件，并结合稀释，建立一种溶剂标定量的方法，增加方法的适用性和便捷性。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

标准物质：灭多威，丁硫克百威，异丙威，甲硫威，三羟基克百威，杀线威，呋线威，猛杀威，硫双威，恶虫威，乙硫苯威，苯氧威，涕灭威等32种农药均为100 μg/mL，购自农业部环境保护科研监测所。

试剂：乙腈、甲醇（色谱纯，美国默克公司）；甲酸（质谱级，美国Sigma公司）；乙酸铵（质谱纯，美国Sigma公司）；水（屈臣氏）；提取包（6 g无水硫酸镁，1.5 g乙酸钠）；净化管[a）50 mg C18，50 mg PSA，150 mg MgSO4；b）50 mg PSA，50 mg GCB，150 mg MgSO4；c）25 mg PSA，2.5 mg GCB，150 mg MgSO4；d）50 mg PSA，150 mg MgSO4]：博纳艾杰尔科技有限公司；生姜（市售）。

LC-30AD/API 5500高效液相色谱-串联质谱仪（岛津液相/美国AB质谱）；BSA822电子天平（德国赛多利斯股份公司）；Allegra 64R冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；E0F0-945066多管漩涡混合器（美国Talboys）；K600食品加工机（德国博朗）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制

1.2.1.1 溶剂标的配制

将标液用色谱级甲醇溶解稀释并定容成10 μg/mL，冷藏保存（0～4 ℃）。使用前配制成不同浓度的混合标准工作液。

1.2.1.2 基质标的配制

取空白样品，按照1.2.2小节前处理方式，取得上机液。按照不同的稀释比，用甲醇稀释，配制基质标。

标液过0.22 μm PTEF滤膜上机。

1.2.2 样品前处理

准确称取15 g（精确至0.01 g）均质后的样品于干净离心管中，放入一颗均质子，加入15 mL乙腈。用多管涡旋混合器按2 500 r/min振荡20 min，加入提取包，振荡2 min后，按8 000 r/min离心5 min。取1 mL上清液，加入净化管中，用多管涡旋混合器涡旋净化1 min，按4 000 r/min离心。将离心后上清液，按照稀释比用甲醇稀释处理。处理后上清液过0.22 PTEF滤膜待上机。

1.2.3 仪器条件

1.2.3.1 色谱条件

色谱柱：Shim-pack XR-ODSⅢ 2.0 mm×150 mm，2.2 μm；水相流动相（流动相A）：0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵；有机流动相（流动相B）：甲醇；流速：0.2 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；梯度洗脱程序：流动相A为0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇；初始流动相1% B，1 min 35% B，6～10 min 37% B，7 min 45% B，23～26 min 98% B，26.1～29 min 1% B，29.1 min STOP。

1.2.3.2 质谱条件

正离子模式，离子源：ESI；喷雾电压（IS）：5 500 V；雾化器压力（GS1）：45 psi；气帘气压力（CUR）：38 psi；辅助气压力（GS2）：45 psi；离子源温度（TEM）：500 ℃。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 液相色谱条件的选择

2.1.1.1 流速和梯度的调整

32种农药均为氨基甲酸酯类农药，有较多的同分异构体，如涕灭威和丁酮威、丁酮威砜和涕灭威砜等。为了更好地分离，使用了1%的有机相作为初始流动相，同时在1～7 min采取了比较缓和的梯度，便于涕灭威和丁酮威的分离。最终确定表1的梯度洗脱方案，并考察了流速，比较了0.2和0.3 mL/min的流速，采用了分离效果较好的0.2 mL/min的流速。

2.1.1.2 进样体积

在同样的条件下，进样体积越小，目标物更易得到较高的离子化程度，使得基质效应更低[7]。较高的进样量也会增加溶剂效应。经试验总结，确定进样体积为2 μL。

2.1.2 质谱参数的优化

针泵进样，优化出农药的子母离子、仪器参数等。根据备选子离子的受干扰和实际响应情况，对备选的子离子进一步筛选，确定检测用子离子。涕灭威和杀线威选用[M+NH4]+。文章还考察了丁酮威的[M+NH4]+和[M+Na]+。在该文条件，丁酮威的[M+Na]+的子离子与[M+NH4]+的子离子相比，响应更好，且被涕灭威子离子干扰较小。故丁酮威选择了[M+Na]+为检测母离子。优化后的质谱参数见表1。32种氨基甲酸酯类总提取离子色谱图见图1。

图1 32种氨基甲酸酯类总提取离子色谱图

表1 质谱参数表

接表1

2.2 前处理条件优化

2.2.1 净化方式的选择

QuEChERS净化材料有GCB，PSA，C18。C18净化剂属于反相吸附剂，可以除去脂肪、类脂。PSA净化剂可以有效去除样品中脂肪酸、某些极性亲脂性色素、蜡质和糖类等。而GCB可以吸附平面结构的色素和甾醇，在吸附色素方面，有另外两种净化材料不可比拟的效果。试验取1 mL提取液净化，考察了四种净化方式：a）50 mg C18，50 mg PSA，150 mg MgSO4；b）50 mg PSA，50 mg GCB，150 mg MgSO4；c）25 mg PSA，2.5 mg GCB，150 mg MgSO4；d）50 mg PSA，150 mg MgSO4。

对试验结果分析后发现，从回收率上看，a净化管与d净化管相比回收率普遍较差，这表明C18对氨基甲酸酯类农药存在明显吸附，与冯婉莹等[5]研究结果相同。GCB净化效果明显，它的添加会提高响应比较差（如久效威）的农药的回收率和重复性。图2是姜中久效威四种净化方式的效果图。净化方式b定量离子的信噪比最高，而净化方式a和d在净化后仍有干扰。

图2 姜加标样品在四种（a、b、c、d）净化方式处理后的久效威两个提取离子（219.1/57.0，219.1/76.0）提取离子图

四种净化方式的回收率如图3所示。

图3 四种净化方式净化姜的加标回收率

GCB是把双刃剑，它也会吸附平面结构的农药[8]。文章发现GCB对姜中平面结构农药有吸收。但是吸收与GCB的含量有关，且对回收率的影响与其他基质相比较少，这可能是因为姜中平面结构基质（色素等）较多。平面结构的基质对农药起到了保护作用，减少了GCB对平面结构农药的吸附。综合SRSD值考虑，选择了c作为筛查方法的净化方式。

2.2.2 稀释倍数

根据液质的原理，稀释会降低农药的基质效应[9]。文章尝试通过稀释减少农药基质效应。试验尝试了稀释5倍和稀释25倍，结果如图4所示。

由图4可以看到。稀释5倍回收率变化明显。稀释25倍大多数农药回收率变化不大。稀释同样使得农药的SRSD值变小。

图4 稀释倍数对农药回收率的影响

2.3 方法学评价

对32种农药进行3个浓度水平的加标试验，每个浓度水平重复6次，具体数据见表2。表2中的标准曲线为溶剂标曲，加标数据为溶剂标定量结果。表2中的定量限是结合加标样品和基质标曲中农药定量离子响应，以信噪比（rSN）为10，确定方法的定量限。

表2 32种农药在生姜基质加标的平均回收率，相对标准偏差，线性方程和定量限（n=6）

丁酮威和久效威在50，75和100 μg/kg加标。丁酮威回收率75.20%～109.65%，SRSD为7.50%～10.59%，定量限为1.7 μg/kg。久效威回收率在72.64%～80.23%之间，SRSD在8.5%～14.77%之间，检出限为30 μg/kg。

在试验条件下，三种基质中32种农药的平均回收率（63.06%～109.65%）和SRSD（2.08%～14.77%）均满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[10]的要求。溶剂标和基质标，呈现良好的线性，相关系数＞0.99。除久效威外其余农药在10 μg/kg回收率均在80%以上，65%的农药在10 μg/kg加标回收在90%以上。32种农药的定量限，除久效威为20 μg/kg，其余农药均在0.05～1.8 μg/kg。

试验结果表明，相应农药的定量限小于文献中传统QuEChERS方法的定量限。许文娟等[11]对5种蔬菜17种氨基甲酸酯类农药进行检测的定量限是2.7～5.5 μg/kg。冯婉莹等[5]检测菠菜中五种氨基甲酸酯类农药定量限在0.25～0.5 μg/kg。文献同时提到不采用基质校正，回收只有40%～50%。久效威定量限为30 μg/kg，也小于文献中的王连珠等[12]方法的定量限50 μg/kg。陈俊秀等[12]检测了胡萝卜中五种氨基甲酸酯类农药，定量限为3～16 μg/kg。这主要是因为液质的基质效应多为基质抑制[6,11]。五倍稀释后，信噪比的降低要小于稀释倍数。方法条件的优化和仪器灵敏度的提高，也是定量限降低的原因。采用稀释方法，也会因为干扰浓度减少，使得SRSD值略小。陈俊秀等[13]检测的5种农药的SRSD值为12.01%～15.02%，文章相应农药的SRSD值为2.18%～9.89%。其他农药，如丁酮威及其代谢物、兹克威等，文献中对其检测方法的研究较少，但是其均为曾广泛使用，但目前被欧盟等禁用的农药。其检测数据表明，方法能满足它们的检测需要。

目前在果蔬农药多残留检测中，QuEChERS方法须通过基质标校正基质效应。基质对农药的影响各不相同。在筛查时，选择有代表性的基质配制基质标，比较困难。虽然有研究通过试验数据建议在果蔬农残监测中选择某种样品作为代表基质，但是这种试验多有其局限性[6]，无法达成定论。Ferrer等[9]的研究发现稀释15倍，其研究中的65%的农药基质效应可忽略不计。但是早期仪器的灵敏度不足，限制了该方法的应用。

文章的试验结果表明：在目前的仪器条件下，通过优化试验方法和稀释减少基质效应，已经具备可行性。随着仪器灵敏度的提高，稀释法降低基质效应，以其通用性和简便性必将是未来校正基质效应的趋势。

2.4 实际样品的检测

检测了本地20批生姜样品，结果均未检出。将方法扩展应用于日常检测中出现的三个韭菜和二个辣椒中克百威阳性样品的检测，两个平行样品的相对偏差＜10%，回收率＞90%。

3 结论

文章建立了QuEChERS-LCMSMS测定姜中32种氨基甲酸酯类农药残留检测的方法。方法采用改进的QuEChERS方法处理，溶剂标定量。该方法具有检出限低、重复性好、操作简便的优点，可以满足基层地区农药残留量筛查的需要。文章选用姜这种富含硫化物的蔬菜，基质在果蔬中较为复杂[11]。32种农药也有一定的代表性。文章证明了稀释降低基质效应方法的可行性，为降低基质效应提供了新的思路。