木姜叶柯茶汤中总黄酮的加工稳定性

夏旭，庾卓思，吕宗浩，杨建琳，胡应祥，向小乐*

1.怀化市农业科学研究院（怀化 418000）；2.长沙理工大学（长沙 410000）；3.湖南富农甜茶有限责任公司（怀化 418000）

木姜叶柯（Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun），为壳斗科柯属常绿乔木，根据典籍记载木姜叶柯有着悠久的民间饮用历史[1]，是一种药食两用，兼有茶、糖、药三种功能的植物[2]，并于2017年被纳入新食品原料目录。木姜叶柯广泛分布于我国长江以南各省区海拔500～2 500米以上的低山密林中[3-4]，在湖南怀化地区又称为芷江甜茶或溆浦瑶茶，目前已经实现了木姜叶柯茶的产业化种植。

木姜叶柯含有丰富的黄酮类和三萜类成分，三叶苷、根皮苷和3-羟基根皮苷等二氢查尔酮类化合物为其主要黄酮类成分和甜味成分[4-6]，其中三叶苷甜度为蔗糖的300倍，热量极低。研究表明木姜叶柯及其提取物有降糖、抑菌、抗过敏、抗氧化等功效[1-5,7-8]。因此，木姜叶柯制茶与普通的绿茶相比有含有天然甜味，不易产生茶多酚沉淀物，具有抗氧化、降糖降脂功效等优点，是一种前景广阔的茶饮。目前研究人员对木姜叶柯叶提取物生物学活性的研究较为多见，对木姜叶柯茶汤的加工特性研究则尚未见报道，研究拟对木姜叶柯茶饮中总黄酮的加工稳定性进行研究，旨在为木姜叶柯茶饮的加工应用和产业链延展提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木姜叶柯茶由湖南富农甜茶有限责任公司提供，产地：怀化芷江。

芦丁标准品（纯度＞98%，上海金穗生物科技有限公司）；氯化铜：化学纯；盐酸、氢氧化钠、亚硫酸钠、30%过氧化氢、氯化钠、氯化钾、氯化镁、无水氯化钙、硝酸铝、氯化铁、L-抗坏血酸、苯甲酸钠、柠檬酸、蔗糖、葡萄糖、焦磷酸钠、山梨酸钾等试剂均为市售分析纯。

1.2 主要仪器与设备

DHG-9070A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；800Y多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）；ATX224电子天平（日本岛津）；HH-6数显恒温水浴锅（常州市普天仪器制造有限公司）；722可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；PHS-3C pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.3 茶汤的制取

木姜叶柯干制茶叶用粉碎机粉碎，过0.250 mm筛网后，作为供试茶样。供试茶样按0.2%茶水比于沸水中提取2 min，期间搅拌数次。提取完成后，自然冷却，用定量滤纸过滤，即为样品茶汤。

1.4 标准曲线绘制和总黄酮测定

参照夏旭等[9]建立的方法，精密称取200 mg芦丁标准品于100 mL容量瓶中，用70%甲醇定容作为母液。吸取0，0.5，1，2，3和4 mL芦丁母液分别置于25 mL容量瓶中，补加70%甲醇至10 mL，再加5% NaNO2溶液1 mL，摇匀，放置6 min；加10% Al(NO3)3硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min；加入4% NaOH氢氧化钠溶液10 mL，再加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，放置15 min；以空白试剂做参比，在波长510 nm处绘制芦丁标准曲线和测定木姜叶柯总黄酮。

1.5 不同因素对木姜叶柯总黄酮稳定性的影响

1.5.1 储存时间和光照对总黄酮稳定性的影响

向洁净的具塞试管中加入木姜叶柯茶汤，分成2组分别置于室内试管架和室外阳光直射下储存，间隔时间取样，按照黄酮类化合物的检测方法检测吸光度，记录数据并绘图。

1.5.2 pH对木姜叶柯茶汤稳定性的影响

分别量取50 mL制备好的木姜叶柯茶汤置于10个小烧杯中用氢氧化钠稀释液及盐酸稀释液将茶汤样液pH调节至2～11，在波长510 nm处测定吸光度。

1.5.3 还原剂Na2SO3对木姜叶柯茶汤稳定性的影响

在加有10 mL样品茶汤的试管中，分别加入Na2SO3配制成0.01%，0.02%，0.03%，0.04%和0.05%的溶液，避光放置30 min后，在波长510 nm下测定吸光度。

1.5.4 氧化剂H2O2对木姜叶柯茶汤稳定性的影响

在加有10 mL样品茶汤试管中，分别加入H2O2配制成0.25%，0.5%，1%，1.5%和2%溶液，避光放置30 min后，在波长510 nm下测定吸光度。

1.5.5 食品添加剂和糖对木姜叶柯茶汤稳定性的影响

在加有10 mL样品茶汤试管中，分别加入下列食品添加剂配制成相应浓度的溶液：0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%抗坏血酸、柠檬酸，0.05%，0.1%，0.15%，0.20%和0.25%苯甲酸钠、山梨酸钾，以及2%，4%，8%，8%和10%蔗糖和葡萄糖。摇匀后，避光放置30 min，在波长510 nm下测定吸光度。

1.5.6 金属离子对木姜叶柯茶汤稳定性的影响

在加有10 mL样品茶汤的试管中，分别加入金属离子Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Al3+、Fe3+溶液，使得金属离子在茶汤中的质量分数分别为0.01%，0.02%，0.03%，0.04%和0.05%，避光放置30 min后取上层清液，在波长510 nm下测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 木姜叶柯茶汤中总黄酮含量测定

测定芦丁标品的吸光度，得芦丁标准曲线的回归方程：y＝30.067x+0.046 1（R=0.999 2），说明总黄酮含量与吸光度线性关系良好。木姜叶柯茶汤的吸光度为0.194±0.025，根据标准曲线，求得木姜叶柯茶汤中总黄酮含量约为0.005 mg/mL，折合总黄酮提取率约为0.25%，显著低于有关研究[10-11]，可能是因为茶汤煮制时间太短。为表示方便，下文均以吸光度的变化来表示木姜叶柯总黄酮含量的变化。

图1 芦丁标准曲线

2.2 储存时间和光照对木姜叶柯总黄酮稳定性的影响

在室内避光贮藏，木姜叶柯总黄酮吸光度随时间（0～8 h）的延长保持平缓不显著降低的趋势，茶汤颜色随着时间的延长而加深，可能原因是茶汤中存在的黄酮类和儿茶素类等呈色成分发生氧化所致[12]；在室外阳光直射条件下（6月），木姜叶柯总黄酮吸光度变化较大，先上升后又随之下降，可能是黄酮类化合物在自然光的条件下发生水解、异构化、氧化等原因导致的，随后又因为光氧化作用导致黄酮类成分进一步被破坏[13-14]，茶汤颜色也随着时间的延长而加深但是加深的程度比室内的更少，可能是因为是光氧化进一步破坏了呈色成分，这说明室内避光条件下，木姜叶柯总黄酮的稳定性优于阳光直射条件。

图2 储存时间和光照对总黄酮稳定性

2.3 pH对木姜叶柯总黄酮稳定性的影响

由图3可知，在pH 2～7范围内，木姜叶柯茶汤的吸光度在酸性条件下变化较小，且随着pH的增加吸光度逐步升高，在pH 6附近有最大吸光度，说明此时的木姜叶柯总黄酮含量最高，研究结果和朱新鹏等[15]的相关研究类似，原因可能是总黄酮苯环结构中含有酚羟基，显弱酸性，所以总黄酮在该pH附近的弱酸性环境中比较稳定[16]。在碱性条件下，木姜叶柯黄酮稳定性较差，当pH＞9时吸光度迅速降低，说明木姜叶柯茶汤中黄酮类化合物在碱性较强的环境中容易受到破坏，表现出不稳定性，在酸性条件下稳定性较好，因而弱酸性条件有利于木姜叶柯总黄酮的储存。

图3 pH对总黄酮稳定性的影响

2.4 还原剂Na2SO3对木姜叶柯总黄酮稳定性的影响

从图4可以看出，还原剂Na2SO3的加入使得吸光度降低，可见还原剂Na2SO3对木姜叶柯黄酮化合物有较强的破坏作用。可能的原因是Na2SO3使得黄酮类化合物的结构被破坏[17]，从而导致总黄酮含量下降，随着Na2SO3浓度的增大，黄酮类化合物的呈现出一定的下降趋势。所以，在木姜叶柯茶汤的生产、存储过程中应该避免与还原能力较强的还原剂Na2SO3等接触。

图4 还原剂Na2SO3对总黄酮稳定性的影响

2.5 氧化剂H2O2对木姜叶柯总黄酮稳定性的影响

从图5可以看出，与空白样相比，0～2%浓度处理下随着H2O2浓度的增大，吸光度不断下降，这表明木姜叶柯总黄酮在氧化剂的环境中容易受到破坏，在加工和储存时应注意避免与氧化剂的接触。有文献[18]表明，总黄酮会表现出一定的抗氧化性，但研究吸光度呈现出快速下降趋势，可能是因为总黄酮含量过低。

图5 氧化剂H2O2对总黄酮稳定性的影响

2.6 食品添加剂对木姜叶柯总黄酮稳定性的影响

从图6可以看出，在不同浓度的山梨酸钾、苯甲酸钠、L-抗坏血酸和柠檬酸处理下的木姜叶柯总黄酮吸光度呈平稳趋势，说明在食品添加剂允许使用的浓度范围内，山梨酸钾、苯甲酸钠、L-抗坏血酸和柠檬酸对木姜叶柯总黄酮的稳定性影响较小，这和有关报道相似[15]。

图6 食品添加剂对木姜叶柯总黄酮稳定性的影响

2.7 糖类对木姜叶柯总黄酮稳定性的影响

从图7可以看出，2%～10%不同浓度的蔗糖和葡萄糖对木姜叶柯总黄酮吸光度影响均较小，黄酮的稳定性良好，有文献[19]表明白糖对黄酮有一定的保护作用，可能原因是白糖含量增加，溶液中含氧量随之降低，继而抑制了黄酮的氧化分解。

图7 蔗糖和葡萄糖对总黄酮稳定性的影响

2.8 金属离子对木姜叶柯总黄酮稳定性的影响

木姜叶柯总黄酮的稳定性与溶液中的金属离子关系较密切，在相同浓度不同金属离子条件下的木姜叶柯总黄酮稳定性差异很大。如表1所示，K+、Na+对木姜叶柯总黄酮的稳定性基本没有影响；Mg2+及Ca2+对木姜叶柯黄酮类化合物有较小影响；Al3+离子随着浓度的升高对黄酮类化合物有比较大的影响，且茶汤由橙黄色变黄红色后又逐渐消退，可能是发生了络合显色反应[20]；而金属离子Fe3+、Cu2+对木姜叶柯总黄酮的稳定性有显著影响，其中Cu2+可引发褐色絮凝沉淀，而Fe3+引起轻微浑浊并导致茶汤颜色变黑，原因可能是Cu2+与木姜叶柯总黄酮的发生络合沉淀反应，而Fe3+与总黄酮的发生络合显色以及氧化还原反应[21-22]。因此，在生产、贮存及使用过程中应避免与含Fe3+、Cu2+、Al3+的容器接触，木姜叶柯茶汤用水应尽量去除这些离子。

表1 不同金属离子对总黄酮稳定性的影响

3 结论与讨论

以木姜叶柯为原料，探究了木姜叶柯茶汤中总黄酮的加工稳定性。结果表明：随着光照时间的增长会降低木姜叶柯茶汤中总黄酮的稳定性；木姜叶柯总黄酮在pH为6左右的弱酸性条件下比较稳定，氧化剂H2O2和还原剂Na2SO3均会导致木姜叶柯总黄酮稳定性下降；食品添加剂苯甲酸钠、抗坏血酸、柠檬酸和山梨酸钾以及糖类蔗糖、葡萄糖等对木姜叶柯总黄酮稳定性影响较小；金属离子中Na+、K+对木姜叶柯总黄酮无影响，Mg2+、Ca2+有较小影响，Al3+离子随着浓度的升高导致木姜叶柯茶汤中的黄酮类化合物稳定性降低，而Cu2+、Fe3+可分别导致络合反应以及络合和氧化还原反应，对其稳定性有明显影响。研究结论可为木姜叶柯茶饮加工提供一定的技术参考。

有研究表明，黄酮类有机分子与金属元素络合形成金属配合物，不仅有可能增强其原有的活性，甚至还可能产生新的药理作用[23]，络合形态的黄酮相比游离态的黄酮有更强的生理活性[24]。研究发现木姜叶柯黄酮与Cu2+极易生成络合物沉淀，未来将对木姜叶柯黄酮的金属络合纯化法和木姜叶柯黄酮-金属离子络合物的抑菌活性等做进一步研究。