E3泛素连接酶TRIM59在肺癌肿瘤相关巨噬细胞中的表达及临床意义

范静芝，耿 彪，付相君，赵文英

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 1.肿瘤内科；2.呼吸内科，安徽 芜湖 241001)

据2020年全球癌症统计报告显示，肺癌每年新发病例约220万，死亡病例约180万，对人类的身体健康构成了极大的威胁[1]。近年来，尽管肺癌诊疗水平不断提高，但其5年生存率仍较低。肿瘤相关巨噬细胞(tumour-associated macrophages,TAMs)是肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中最丰富的免疫细胞，目前研究已证实TAMs与多种恶性肿瘤的发生发展存在直接联系，包括乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌和卵巢癌等[2]。三结构域蛋白59(tripartite motif-59,TRIM59)是TRIM蛋白超家族的重要成员之一，位于细胞内质网上，参与调控细胞周期，具有细胞内信号传递、凋亡、致癌等作用[3]。本课题组前期研究揭示TRIM59可以通过外泌体在肿瘤细胞和肿瘤微环境之间来回穿梭，传递信息，促进肿瘤细胞增殖和侵袭[4]。但TRIM59蛋白在TAMs中的表达水平及其与临床病理参数关系还未了解。本研究通过mIHC法检测肺癌组织微阵列芯片TAMs中TRIM59蛋白表达水平，分析TRIM59的表达水平与临床病理参数和患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 芯片 肺癌组织芯片(OD-CT-RsLug04-001)购于上海芯超公司，芯片纳入了92例肺癌组织及配对癌旁组织，患者的临床病理资料和生存数据完整。

1.1.2 细胞系 人肺癌A549细胞株、人肺癌H1299细胞株和人急性单核白血病THP-1细胞株均来源于中国科学院(上海)细胞库。

1.1.3 主要试剂 TRIM59多克隆抗体(PA5-38726)和CD68多克隆抗体(PA5-109344)购于Invitrogen公司，Opal 4-color fluorescent IHC kit(NEL810001KT)购于Akoya Biosciences公司，DAPI染色工作液、RIPA裂解液和BCA试剂盒购于碧云天生物技术有限公司，β-actin抗体(3700)购于Cell Signaling Technology公司，佛波酯(16561-29-8)购于Med Chem Express公司，人TRIM59过表达慢病毒颗粒(HG25849-ACGLN)购于Sino Biological公司，TRIM59shRNA(靶标序列:CTGAGGTTCAACCCGTTGAAA)购于Sigma公司，Transwell 24孔板(孔径为8 μm)购于BD Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 多重荧光免疫组化技术(mIHC) 将载玻片用二甲苯和乙醇脱蜡，通过微波进行抗原回收，3%H2O2(新鲜制备)孵育10 min后，室温下用封闭缓冲液封闭10 min，然后4℃孵育一抗过夜，室温下孵育二抗2 h，Opal工作溶液孵育10 min，用DAPI复染细胞核，加抗荧光淬灭剂封片后，用共聚焦显微镜捕捉荧光信号。

1.2.2 细胞培养及传代 THP-1细胞为悬浮细胞，A549细胞及H1299细胞为贴壁细胞，培养液由含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素和DMEM培养液构成，置于含5% CO2、37℃孵育箱中培养。1～2 d换液1次，3～4 d传代1次。以下实验均取处于对数生长期细胞，所有实验数据均重复3次。

1.2.3 细胞转染 将传代培养的THP-1细胞密度稀释成1×106个/mL，接种于培养皿中，于含100ng/mL佛波酯、0.3%BSA的无血清DMEM培养液中培养72 h诱导分化。通过光镜进行形态学观察，鉴定细胞是否分化为巨噬细胞。取已分化的THP-1源性巨噬细胞接种于6孔板中，并分为：TRIM59过表达组(TRIM59过表达慢病毒感染)、控制对照组(GFP过表达慢病毒感染)、空白对照组(未处理)；TRIM59敲低组(TRIM59shRNA转染)、控制对照组(scrambledRNA转染)、空白对照组(未处理)，分别进行转染，置于孵育箱中培养过夜后，培养液更换为无抗含血清的完全培养液，继续培养24 h。

1.2.4 蛋白印迹法检测 使用RIPA裂解液裂解步骤1.2.3转染细胞，提取总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。经SDS-PAGE分离蛋白后，用半干转膜仪转移蛋白至PVDF膜，脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，加入一抗4℃封闭过夜，再加入对应二抗室温封闭1 h，滴反应液曝光。以β-actin为内参。

1.2.5 Transwell实验 消化收集1.2.3分组转染后的THP-1细胞，用含10%FBS的DMEM培养液调整细胞密度为1.6×105个/mL，取600 μL细胞悬液接种于24孔板Transwell下室。再收集A549细胞、H1299细胞，消化离心后，用无血清的DMEM培养液重悬细胞密度为4×105个/mL，取200 μL细胞悬液接种于24孔板Transwell上室与下室THP-1源性巨噬细胞共培养。放入孵育箱内继续培养约48 h后，取出24孔板中的Transwell小室，用棉签轻轻擦去上层的细胞。用4%多聚甲醛固定20 min后，用0.1%结晶紫染色20 min，PBS液冲洗干净，倒扣小室自然风干。在倒置显微镜下随机取5个视野，拍照并计算细胞的个数及平均值。

1.2.6 细胞克隆形成实验 消化步骤1.2.3分组转染后的THP-1细胞，将其离心后，用无FBS的DMEM培养液重悬细胞密度为3×103个/mL，取1 mL细胞悬液接种于6孔板中。同时消化收集A549细胞、H1299细胞，用无FBS的DMEM培养液调整细胞密度为3×103个/mL，每孔取1 mL细胞悬液接种于对应6孔板中与THP-1源性巨噬细胞共培养。每天观察，当肉眼可观察到克隆形成时，终止培养(2周左右)。弃上清，PBS洗涤细胞2次，用4%多聚甲醛固定20 min后，用0.1%结晶紫染色20 min，后用PBS液浸洗干净，自然风干。用数码相机拍照储存图片，计数。

2 结果

2.1 肺癌TAMs中E3泛素连接酶TRIM59的表达水平与临床病理参数的关系及对患者预后的影响 mIHC法检测结果显示，与癌旁肺组织中的巨噬细胞相比，肺癌TAMs中E3泛素连接酶TRIM59的表达水平明显上调(见图1)。应用Image J软件定量分析肺癌微环境TAMs中TRIM59的表达水平，TAMs中TRIM59的平均荧光强度(MFIs)<100a.u.(arbitrary units,a.u.)时为低表达，而TRIM59的MFIs≥100a.u.时则为高表达。根据TAMs中TRIM59的MFIS评分，92例患者中有45例患者为高表达，47例患者为低表达。结果显示，TAMs中E3泛素连接酶TRIM59的高表达与淋巴结转移、肿瘤分期、远处器官转移有关(P<0.05)，见表1。

TRIM59表达(红色荧光)，CD68标记巨噬细胞(黄色荧光)，细胞核用DAPI标记(蓝色荧光)。

表1 TAMs中TRIM59蛋白表达水平与肺癌患者临床病理参数的关系

Kaplan-Meier生存分析表明，与TAMs中TRIM59低表达的患者相比，TAMs中TRIM59的表达水平升高的患者总生存期较差(P<0.001)，见图2。

图2 肺癌TAMs中TRIM59的表达与患者总生存期的Kaplan-Meier生存曲线

2.2 巨噬细胞过表达TRIM59促进肺癌细胞侵袭 Transwell实验结果显示，巨噬细胞过表达TRIM59可增强肺癌细胞A549和H1299的侵袭能力(P<0.01)；相反通过TRIM59shRNA敲低THP-1源性巨噬细胞TRIM59蛋白后，则抑制巨噬细胞的促肿瘤侵袭作用(P<0.01)，见图3C、D。

2.3 巨噬细胞过表达TRIM59促进肺癌细胞的增殖 细胞克隆形成实验结果显示，与控制对照组细胞相比，巨噬细胞过表达TRIM59可增强肺癌细胞A549和H1299的增殖能力(P<0.01)；相反通过TRIM59shRNA敲低THP-1源性巨噬细胞中TRIM59蛋白后，则抑制巨噬细胞的促肿瘤增殖作用(P<0.01)，见图4B、C。

A.Transwell实验中THP-1源性巨噬细胞与肺癌细胞共培养实验示意图。B.WB法检测THP-1源性巨噬细胞过表达或敲低TRIM59蛋白水平。C～D.THP-1源性巨噬细胞过表达或敲低TRIM59对A549、H1299细胞侵袭能力的影响(C：F=28.661和F=208.726，D：F=80.479和F=461.314，P<0.01)。**P<0.01。

3 讨论

肺癌的发生发展是一个多步骤、复杂的过程，涉及到复杂的网络调控机制[5]。TME是肿瘤细胞赖以生存的内环境，主要包括血管、免疫细胞、成纤维细胞和细胞外基质等[6]。越来越多的证据表明，肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互作用是促成恶性肿瘤转移的必要条件[7]。肿瘤细胞可通过自分泌和旁分泌，改变和维持有利于自身生存和发展的局部微环境条件[8]；肿瘤微环境亦可通过代谢、分泌、免疫等功能的改变，促进肿瘤细胞的侵袭和转移[9]。

有研究[10]表明，TRIM59在胃癌组织中的表达水平高于癌旁组织，且TRIM59表达水平与肿瘤分期、远处转移、肿瘤浸润深度存在相关性，生存分析显示，与TRIM59低表达患者相比，TRIM59高表达患者的总生存期明显缩短。通过体外、体内功能验证实验发现，TRIM59通过促进P53泛素化蛋白酶体降解，抑制P53活性从而促进肿瘤细胞的增殖、克隆形成和转移。另有研究[11]同样表明，在肺癌患者中，与癌旁组织相比，肿瘤组织中TRIM59的表达水平显著上调，并且TRIM59的表达水平与患者的肿瘤负荷存在相关性，TRIM59可以作为患者预后的独立危险因素，机制研究显示，TRIM59主要通过调控CDK6的表达来发挥其促肿瘤作用。本研究用mIHC法检测肺癌组织微阵列芯片发现，与癌旁组织中的巨噬细胞相比，TRIM59蛋白在肺癌TAMs中表达水平显著升高，其表达水平与淋巴结转移、肿瘤分期、远处器官转移有关。生存分析结果显示，TAMs中高表达TRIM59的肺癌患者总生存期较差，这些临床数据表明，TRIM59作为一个重要的癌蛋白，可能会作为肺癌的潜在预后和治疗靶标。

A.细胞克隆形成实验中THP-1源性巨噬细胞与肺癌细胞共培养示意图。B～C.THP-1源性巨噬细胞过表达或敲低TRIM59蛋白对A549、H1299细胞增殖能力的影响(B：F=126.539和F=154.600，C：F=364.628和F=273.067，P<0.01)。**P<0.01。

免疫环境在肿瘤发生发展中起着至关重要的作用，巨噬细胞是多种疾病发生的关键免疫细胞，对其进行研究可以为肿瘤治疗提供更多的可能[12]。TAMs具有很强的可塑性，容易被其所处的环境诱导而极化成不同的类型[13]。在肿瘤环境的应激驯化下，TAMs大多表现为促癌作用，如刺激肿瘤细胞增殖、转移和血管生成[14]。TAMs可以迅速适应肿瘤微环境的变化，在功能上接近但不完全等同M2型巨噬细胞表型，并促进微环境免疫抑制与肿瘤进展[13]。TAMs介导的免疫抑制主要与微环境中浸润的T细胞的种类、功能相关。为了模拟肿瘤微环境TAMs中TRIM59的表达水平，本研究利用TRIM59过表达慢病毒感染THP-1源性巨噬细胞、TRIM59shRNA转染THP-1源性巨噬细胞，Transwell实验和细胞克隆形成实验结果表明，与对照组相比，巨噬细胞过表达TRIM59增强肺癌细胞侵袭和增殖能力，抑制TRIM59表达，则遏制了巨噬细胞的促肿瘤细胞侵袭和增殖作用，表明TAMs中TRIM59表达水平升高促进了肺癌细胞的侵袭转移和增殖能力。

综上所述，E3泛素连接酶TRIM59在肺癌TAMs中表达水平升高，其表达水平与淋巴结转移、肿瘤分期、远处器官转移有关。肺癌TAMs中TRIM59的表达水平升高的患者总生存期较差。体外实验也进一步证明上调巨噬细胞中TRIM59的表达水平促进了肺癌细胞的侵袭和增殖能力，下调TRIM59的表达则遏制了巨噬细胞的促肿瘤作用。这些结果的发现表明TAMs中E3泛素连接酶TRIM59蛋白表达水平升高对肺癌肿瘤进展起到重要作用。