外周血microRNAs用于肺炎合并脓毒症诊断及预后评价的价值

卞淼 逄利

脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征，病情危重、救治难度大、死亡率高。重症肺炎是导致脓毒症的常见病因，早期识别可能发展为脓毒症的重症肺炎患者并进行干预有助于降低脓毒症发生率、改善预后[1-2]。炎症反应激活是重症肺炎及脓毒症发生发展的病理生理基础，微小RNA(microRNA，miR)是一类在体内分布广泛的小分子RNA，肺内多种miRs参与炎症反应的调控，不仅可以作为防治肺部感染及肺损伤的靶点，还能作为评价病情及预后的外周血标志物[3]。一项动物实验通过全血miR芯片检测技术证实，脓毒症小鼠模型中miR-let-7d、miR-15b、miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107、miR-451的表达发生显著变化[4]，提示上述几种miRs可能参与脓毒症的发病。本研究将以此为基础，对上述几种miRs用于肺炎合并脓毒症诊断及预后评价的价值展开探讨。

资料与方法

一、研究对象

选择2019年1月—2021年8月期间在我院就诊的肺炎患者，纳入标准：(1)符合《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)》[5]中的诊断标准；(2)临床资料完整；(3)入院后留取外周静脉血；排除标准：(1)入院前接受过抗感染治疗；(2)合并肺结核、支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺脓肿等肺疾病；(3)合并恶性肿瘤、正在接受激素治疗的患者。共纳入128例肺炎患者，根据《中国脓毒症/脓毒性休克急诊治疗指南(2018)》[6]将其分为肺炎合并脓毒症组、不合并脓毒症的肺炎组。另取同期在我院体检的60例健康者作为对照组。肺炎合并脓毒症组共45例，男25例、女性20例，年龄41～67岁、平均(58.59±9.39)岁；肺炎组共83例，男性51例、女性32例，年龄38～68岁、平均(60.03±8.57)岁；对照组中男性36例、女性24例，年龄35～65岁、平均(58.77±9.32)岁。三组间一般资料的比较无统计学差异(P>0.05)。本研究取得医院委员会批准[临审第(2021-216号)]。

二、研究方法

1 外周血miRs表达水平的检测 取三组受试者的外周静脉血3 mL。采用全血RNA提取试剂盒(北京天根公司)分离外周血RNA，采用miR cDNA第一链合成试剂盒合成将miR反转录为cDNA，采用miR荧光定量检测试剂盒配置miR检测的PCR反应体系，具体如下：cDNA 2μL、试剂盒内反应液10μL、10μmol/L上游引物0.4μL、试剂盒中的通用下游引物0.4μL、去离子水补足至20.0μL。将上述反应体系放入荧光定量PCR仪(Bio-rad公司)，按照下列程序进行荧光定量PCR反应：95℃ 15 min后94℃ 20s、60℃ 34s、重复40个循环。反应结束后生成循环曲线并得到循环阈值，以U6为内参，计算miR-let-7d、miR-15b、miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107、miR-451的表达量。

2 肺炎合并脓毒症病情严重程度的评估 查阅肺炎合并脓毒症患者的病历，采用以下指标评估病情严重程度：急性生理和慢性健康评分Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ，APACHEⅡ)、白细胞计数(WBC)、中性粒细胞计数(NEU)、超敏C-反应蛋白(hs-CRP)、降钙素原(PCT)。

3 肺炎合并脓毒症预后的评价 根据入院后28d的生存情况评价预后，包括生存患者和死亡患者。

三、统计学处理

采用SPSS22.0软件录入数据，计量资料以(均数±标准差)表示，3组间比较采用单因素方差分析、两两比较采用LSD-t检验，2组间比较采用独立样本t检验，两计量资料间的相关性采用Pearson相关分析，采用ROC曲线分析miRs用于诊断及预后评价的效能。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、三组受试者外周血miRs表达水平的比较

与对照组比较，肺炎合并脓毒症组、肺炎组的外周血let-7d、miR-15b、miR-107、miR-451表达水平增加，miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103表达水平降低(P<0.05)；与肺炎组比较，肺炎合并脓毒症组的外周血miR-107表达水平增加，miR-16、miR-25、miR-103表达水平降低(P<0.05)，let-7d、miR-15b、miR-92a、miR-451表达水平无统计学差异(P>0.05)(见表1)。

表1 三组受试者外周血miRs表达水平的比较

二、外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107表达水平对肺炎合并脓毒症的诊断价值

外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107表达水平诊断肺炎合并脓毒症的ROC曲线(见图1)，经ROC曲线分析，四项指标区分单纯肺炎与肺炎合并脓毒症的效能(见表2)。

图1 外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107表达水平诊断肺炎合并脓毒症的ROC曲线

表2 外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107表达水平诊断肺炎合并脓毒症的ROC曲线分析

三、外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107与肺炎合并脓毒症病情严重程度的相关性

外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107与肺炎合并脓毒症病情严重程度相关性的Pearson检验如下：肺炎合并脓毒症患者外周血miR-16、miR-25、miR-103表达水平与APACHE Ⅱ评分、WBC、NEU、hs-CRP、PCT呈负相关，miR-107表达水平与APACHE Ⅱ评分、WBC、NEU、hs-CRP、PCT呈正相关(见表3)。

表3 外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107与肺炎合并脓毒症病情严重程度的相关性

四、肺炎合并脓毒症组中生存患者与死亡患者外周血miRs表达水平的比较

与肺炎合并脓毒症组中生存患者比较，死亡患者外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103表达水平降低，miR-107表达水平增加(P<0.05)，let-7d、miR-15b、miR-451表达水平无统计学差异(P>0.05)(见表4)。

表4 肺炎合并脓毒症组中生存患者与死亡患者外周血miRs表达水平的比较

五、外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107表达水平对肺炎合并脓毒症预后的预测价值

外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107表达水平预测肺炎合并脓毒症预后的ROC曲线(见图2)，经ROC曲线分析，五项指标对肺炎合并脓毒症预后的预测效能(见表5)。

表5 外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107表达水平预测肺炎合并脓毒症预后的ROC曲线分析

图2 外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107表达水平预测肺炎合并脓毒症预后的ROC曲线

讨 论

重症肺炎病情重，严重者会发展为脓毒症，临床救治难度大、死亡率高[7-8]。因此，深入认识普通肺炎向脓毒症发展的病理生理机制具有迫切的临床需求。miR是近些年分子生物学领域及表观遗传学领域的热门分子，目前的研究认为炎症反应的激活受到多种miR的调控，不同的miRs能够在转录后水平调节Toll样受体、核因子-κB、沉默信息调节因子1等基因的表达，进而起到促炎或抗炎作用。在肺炎、胰腺炎等感染性疾病的研究中，相关的动物模型中及相关的患者外周血中均存在多种miRs表达的变化[9-12]，提示miRs参与感染性疾病的发生发展且可以作为诊断疾病或评价病情的标志物。

本研究使用外周血miRs作为标志物、进行肺炎合并脓毒症的诊断及预后评价。Hsieh CH的研究在脂多糖诱导的脓毒症小鼠模型中通过miRs芯片检测证实miR-let-7d、miR-15b、miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107、miR-451的表达发生显著变化。本研究检测了肺炎患者及肺炎合并脓毒症患者外周血中上述miRs表达的变化，与肺炎患者比较，肺炎合并脓毒症组的外周血miR-107表达水平增加，miR-16、miR-25、miR-103表达水平降低，提示四种miRs可能参与肺炎合并脓毒症的发生；进一步经ROC曲线分析证实四种miRs对区分单纯肺炎与肺炎合并脓毒症具有诊断价值，提示四种miRs可以用于肺炎合并脓毒症的早期诊断。

国内外相关的研究结果认为miR-16、miR-25、miR-103起到抗炎作用，miR-107起到促炎作用。孙小平的研究证实，miR-16可能通过与PPARγ相关作用的方式在脓毒症细胞模型中抑制多种炎症细胞因子的释放[13]；吴斌[14]和Yao Y[15]的研究在脓毒症引起肾损害和心肌损害的模型中证实miR-25起到组织保护作用、显著减轻炎症反应；Yang M的研究证实miR-103靶向抑制Toll样受体4介导的炎症反应[16]；Wang S.的研究证实miR-107诱导肿瘤坏死因子-α的释放并促进炎症反应的激活[17]。本研究分析了四种miRs表达水平与肺炎合并脓毒症病情的相关性，结果显示：APACHE Ⅱ评分、WBC、NEU、hs-CRP、PCT等反映病情严重程度的指标与miR-107呈正相关，与miR-16、miR-25、miR-103呈负相关，表明在肺炎合并脓毒症的发病过程中miR-107表达增加及miR-16、miR-25、miR-103表达降低与病情加重、炎症反应激活有关。

最后，本研究还对肺炎合并脓毒症患者的预后进行了评价。肺炎进展为脓毒症后极大地增加了救治难度，临床患者的死亡率较高。本文评价了肺炎合并脓毒症患者的28d生存和死亡情况，45例患者中共14例死亡、死亡率31.11%；通过比较生存与死亡患者外周血 miRs的差异可知：与生存患者比较，死亡患者外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103表达水平降低，miR-107表达水平增加；进一步进行ROC曲线分析可知：上述五种miRs对肺炎合并脓毒症患者的28d生存和死亡情况具有预测价值。

综上所述，外周血多种miRs可用于肺炎合并脓毒症的诊断及预后评价；miR-16、miR-25、miR-103、miR-107可用于肺炎合并脓毒症的诊断且与病情严重程度相关；miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107可用于肺炎合并脓毒症患者预后的预测。本研究的以上结果为今后深入认识肺炎合并脓毒症发生的病理生理机制、发现新的防治靶点及评估的分子标志物提供了临床研究依据。