黄芪甲苷通过HMGB1/NF-κB通路减轻脓毒症大鼠相关肺损伤

赵雅彬 李琨琨 张志伟 杨宁 运苛政 孙同文

脓毒症是由病原微生物感染引起的全身炎症反应综合征，是危重症的常见并发症，死亡率高达30%[1]。全球每年约1900万人罹患脓毒症，肺脏是脓毒症导致多脏器功能损伤中较早损伤的脏器，表现为急性肺损伤[2-3]。目前脓毒症临床治疗所使用的抗生素类药物，因毒副作用大且易引起药物依赖性，亟需开发安全高效的新型药物[4]。黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ, AS-Ⅳ)是提取自黄芪的主要活性成分之一，具有抗炎消肿、调节免疫功能和镇痛等作用[5]。研究发现，AS-Ⅳ能够有效减轻脓毒症大鼠全身炎症反应，但其作用机制尚不明确[6]。因此，本研究旨在建立脓毒症大鼠肺损伤模型，探讨AS-Ⅳ对肺损伤的改善作用及其可能作用机制，为AS-Ⅳ药物开发及脓毒症临床治疗提供参考。

资料与方法

一、材料

1 实验动物 60只SPF级雄性SD大鼠，体质量220～250 g，由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(浙)2019-0001。所有实验动物在温度20℃～24℃，相对湿度50%～60%，自然昼夜节律光照的环境中适应性饲养7 d，所有饲养设备均经过高压、高温灭菌，适应期间可自由获取食物和水，垫料每日进行更换(伦理编号：2022-2xyy-008)。

2 药品、主要试剂和仪器 AS-Ⅳ(纯度≥98%，上海吉至生化科技有限公司，货号：A70100)；肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒(深圳科润达生物工程有限公司，货号：ELH-TNF-α)；白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)ELISA试剂盒(深圳海思安生物技术有限公司，货号：HAS-47926，HAS-48678)；兔抗大鼠β-actin多克隆抗体、兔抗大鼠高迁移率族蛋白B1(High mobility group proteins B1, HMGB1)、核因子-κB p65(nuclear factor- κB, NF-κB p65)多克隆抗体、山羊抗兔二抗IgG(上海晶抗生物有限公司，货号：JKR18050，JKR6202，JKR19225)。IQ5TM型荧光实时定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；石蜡组织切片机(RM2265，德国LEICA公司)。

二、方法

1 脓毒症大鼠模型建立 适应性饲养7 d后，模型组、AS-Ⅳ各剂量组大鼠采用盲肠结扎穿孔法建立脓毒症大鼠模型[7]，术前12 h禁食，自由饮水，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，固定于手术台上，沿腹中线左侧1 cm作一切口，长约1 cm，找到盲肠末端1.5 cm处，手术线结扎22号针穿刺2次，逐层缝合。对照组大鼠只开腹，不进行盲肠的结扎和穿刺。术后大鼠出现呼吸频率明显加快、腹泻，精神萎靡，毛色失去光泽及抓取时全无抵抗之力等表现提示建模成功。

2 分组与给药 60大鼠随机分为对照组12只、模型组(12只)、AS-Ⅳ低剂量组(12只)、AS-Ⅳ中剂量组(12只)和AS-Ⅳ高剂量组(12只)。参照文献[8-9]，AS-Ⅳ低、中、高剂量组灌胃20、40、80 mg/kg AS-Ⅳ混悬液(生理盐水配制)，对照组及模型组于相同时间给予等量生理盐水。各组给药1次/d，连续7 d。

三、检测指标

1 标本采集 末次给药后，所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，翻正反射消失后，开腹。腹主动脉采集血液，于4℃下3000 r/min高速离心机离心15 min，分离血清，-20℃保存。断头法处死大鼠，取出肺组织，使用预冷的生理盐水冲洗肺组织，取部分左肺组织浸入4%多聚甲醛液固定24 h备用，其余左肺组织，-80℃保存备用。

2 肺组织湿干重比(W/D)测定 取出大鼠右肺组织后，滤纸吸取肺组织表面多余血液，天平准确称取右肺组织质量记为湿重，再将肺组织放入80℃烤箱烘烤48 h至恒重，记为干重，计算肺组织W/D。肺组织W/D=肺组织湿重/肺组织干重。

3 炎症因子水平检测 取出血清和试剂盒，恢复至室温后使用，根据TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒说明书操作。试剂盒采用双抗体夹心法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，先用标本稀释液1:1稀释标本50 μL加入反应孔。其余各孔加入待测样品，再加入50 μL生物素抗体工作液，盖上膜板，轻轻震荡混匀，37℃孵育30 min。甩去液体，每孔加入洗涤液，震荡30 s，反复操作3次。再加入80 μL亲和链霉素HRP，37℃温育30 min，洗涤液清洗拍干，加入显色液、终止液，使用酶标测定仪于450 nm波长处检测各孔吸光值，计算样品浓度。

4 肺组织HE染色观察 取出固定后的肺组织，浸泡梯度浓度酒精溶液脱水，再使用二甲苯透明，去除透明剂后进行石蜡包埋，使用切片机切成厚度为5 μm的切片。40℃烘箱烘干，过夜。再将切片常规透明、脱水，放入苏木精染色5 min，自来水冲洗，1%盐酸乙醇分化10 s，自来水冲洗，再次脱水透明。使用中性树胶，盖片封固。观察肺组织病理学变化。

5 肺组织病理学评分 光学显微镜下观察肺组织形态变化，并采用改良版肺组织病理学评分标准[7]对各组大鼠肺组织进行评分，从大鼠肺组织肺间隔厚度、炎性细胞浸润程度、肺泡塌陷程度评定肺组织病变程度，各部分数相加为最终得分。评分越高表明肺组织病变程度越严重，详细评定标准(见表1)。

表1 肺组织病理学评定标准

6 HMGB1、NF-κB p65 mRNA表达 取出备用肺组织并剪碎，加入TRIZOL液静置裂解。按照RNA提取试剂盒说明书操作提取总RNA，检测RNA浓度。反转录试剂盒合成cDNA，配制转录反应体系(20 μL)：R Nase free ddH2O 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，5×g DNA digester Mix 2 μL，4× Hifair Super Mix 5 μL，cDNA 2 μL。反应条件为95℃ 25 s，56℃ 35 s，72℃ 65 s进行40个循环。取样本CT值平均数，以目的基因相对内参的表达量计算各样本之间基因表达差异。引物序列设计为HMGB1-F：5′-GCATCCTGGCTTATCCATTGG-3′、HMGB1-R：5′-GGCTGCTTGTCATCTGCTG-3′；NF-κB p65-F：5′-AGAGGGGATTTCGATTCCGC-3′、NF-κB p65-R：5′-CCTGTGGGTAGGATTTCTTGTTC-3′；β-actin-F：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′、β-actin-R：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。

7 HMGB1、NF-κB p65蛋白表达 取出备用肺组织加入细胞裂解液，冰上充分研磨匀浆等待完全裂解，4℃下12000 rpm离心机离心10 min，收集上清液。使用BCA蛋白浓度试剂盒，检测蛋白浓度。取40 μL样品蛋白，加入配制好的分离胶与浓缩胶，恒压80 V电泳30 min，恒压120 V电泳至溴酚蓝到达底部。260 mA电流下，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶摇床封闭2 h，再加入1:1000一抗稀释液，4℃过夜，TBST充分清洗3次，每次10 min。加入1：3000二抗稀释液，室温封闭60 min，TBST清洗，滴加适量显影液放入凝胶图像分析仪进行显影，保存图像，以β-actin为内参，观察并分析条带上相应蛋白表达量。

四、统计学分析

结 果

一、肺组织W/D比较

与对照组比较，模型组大鼠肺组织W/D升高(P<0.05)。与模型组比较，AS-Ⅳ低、中、高剂量组大鼠肺组织W/D均降低(P<0.05)。与AS-Ⅳ低剂量组比，AS-Ⅳ中、高剂量组大鼠肺组织W/D降低(P<0.05)。与AS-Ⅳ中剂量组比，AS-Ⅳ高剂量组肺组织W/D降低(P<0.05)(见表2)。

表2 各组大鼠肺组织W/D比较

二、炎症因子水平比较

与对照组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05)。与模型组比，AS-Ⅳ低、中、高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。与AS-Ⅳ低剂量组比，AS-Ⅳ中、高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。与AS-Ⅳ中剂量组比，AS-Ⅳ高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)(见表3)。

表3 大鼠血清炎症因子水平比较

三、肺组织HE染色比较

结果显示，对照组大鼠肺组织结构完整，形态正常，未见炎性细胞浸润、水肿等现象。模型组大鼠肺组织严重病变，肺泡间隔明显增宽，肺泡壁明显增厚，部分肺泡可见出血、间质水肿现象，存在大量炎性细胞浸润现象。AS-Ⅳ低、中、高剂量组大鼠肺组织结构受损现象得到改善，肺泡间隔减小，肺泡出血和间质水肿现象减轻，炎性细胞浸润现象减少(见图1)。

图1 肺组织HE染色结果(×200，标尺=50 μm，A:对照组，B:模型组，C:AS-Ⅳ低剂量组，D:AS-Ⅳ中剂量组，E:AS-Ⅳ高剂量组)

四、肺组织病理学评分比较

与对照组比较，模型组大鼠肺组织病理学评分升高(P<0.05)。与模型组比较，AS-Ⅳ低、中、高剂量组大鼠肺组织病理学评分均降低(P<0.05)。与AS-Ⅳ低剂量组比，AS-Ⅳ中、高剂量组大鼠肺组织病理学评分降低(P<0.05)。与AS-Ⅳ中剂量组比，AS-Ⅳ高剂量组肺组织病理学评分降低(P<0.05)(见表4)。

表4 各组大鼠肺组织病理学评分比较 分)

五、HMGB1、NF-κB p65 mRNA水平比较

与对照组比较，模型组大鼠肺组织HMGB1、NF-κB p65 mRNA表达水平升高(P<0.05)。与模型组比，AS-Ⅳ低、中、高剂量组大鼠肺组织HMGB1、NF-κB p65 mRNA表达水平降低(P<0.05)。与AS-Ⅳ低剂量组比较，AS-Ⅳ中、高剂量组大鼠肺组织HMGB1、NF-κB p65 mRNA表达水平降低(P<0.05)。与AS-Ⅳ中剂量组比，AS-Ⅳ高剂量组大鼠肺组织HMGB1、NF-κB p65 mRNA表达水平降低(P<0.05)(见表5)。

表5 大鼠HMGB1、NF-κB p65 mRNA水平比较

六、HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平比较

与对照组比较，模型组大鼠肺组织HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平升高(P<0.05)。与模型组比，AS-Ⅳ低、中、高剂量组大鼠肺组织HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平降低(P<0.05)。与AS-Ⅳ低剂量组比较，AS-Ⅳ中、高剂量组大鼠肺组织HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平降低(P<0.05)。与AS-Ⅳ中剂量组比，AS-Ⅳ高剂量组大鼠肺组织HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平降低(P<0.05)(见表6，图2)。

表6 大鼠HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平比较

图2 肺组织蛋白检测

讨 论

脓毒症患者由于体内感染的病原体毒素持续释放，机体的免疫系统受到过度激活，炎性因子高度表达，导致细胞、组织器官和免疫系统均会受到不可逆的损伤[8]。多达70%的脓毒症患者会出现严重的肺损伤，表现出呼吸困难等表症[9]。针对脓毒症肺损伤的治疗集中在控制感染源、液体治疗、血管活性药物的应用和调节免疫系统。近年来研究发现，一些针对炎症信号通路的靶向药物在脓毒症的治疗中取得良好效用[10]。

黄芪是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，是一种传统的补气中草药，其主要成分包括AS-Ⅳ、黄芪苷、异黄芪苷、三萜皂苷、黄酮及多糖等[11]。AS-Ⅳ作为黄芪的标志成分之一，因其抗炎、活血化瘀的药效临床常用于炎症介质的靶向治疗[12]。本研究采用盲肠结扎穿孔法建立脓毒症大鼠模型，从分子机制上探讨AS-Ⅳ对脓毒症大鼠肺脏损伤的修复作用。结果显示，模型组大鼠肺组织W/D比值、肺组织病理学评分、TNF-α、IL-1β、IL-6均升高，表明脓毒症模型建立成功且模型组大鼠肺组织受到严重损伤，大鼠体内伴有严重的炎症反应。给予不同剂量的AS-Ⅳ治疗后大鼠均表现肺组织W/D比值、肺组织病理学评分、TNF-α、IL-1β、IL-6降低，提示大鼠肺组织损伤得到修复，体内的炎症反应也明显减轻。此外，大鼠肺组织HE染色结果也表明肺泡间隔缩小，肺泡出血和间质水肿现象减轻，细胞肿胀、炎性细胞浸润现象减少。以上结果均证实AS-Ⅳ对脓毒症大鼠肺组织损伤具有修复作用。

在本研究中，与模型组比较，AS-Ⅳ各剂量组大鼠肺组织HMGB1和NF-κB p65 mRNA水平降低，且HMGB1和p-NF-κB p65蛋白表达水平也呈现降低趋势。HMGB1作为下游炎症重要参与因子，在脓毒症的发生、发展中均起到关键作用[13]。在细胞内，HMGB1参与核小体内DNA复制、修复，细胞分化等多种生理过程；释放至细胞外时，HMGB1可介导炎症反应、促进肿瘤生长等，参与更广泛的生物学行为[14]。炎症反应是脓毒症引起脏器损伤的重要机制之一，在脓毒症病程发展中，外周的炎性因子集中在组织已受到破坏的脏器，激活HMGB1/NF-κB通路释放更多的促炎因子从而进一步加强炎症反应，加剧脏器损伤[15]。HMGB1分泌到细胞外发挥促炎作用时，通过与受体结合，激活下游NF-κB信号通路，在脓毒症发展过程中，活化的NF-κB通路能够释放大量TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子，促进炎症级联反应[16]。结合血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平变化，可见AS-Ⅳ能够抑制HMGB1/NF-κB通路，减少NF-κB p65磷酸化，减轻炎症反应，对大鼠肺组织损伤有积极影响。

综上所述，AS-Ⅳ能够改善脓毒症大鼠肺组织损伤，减轻炎症反应，可能是通过抑制HMGB1/NF-κB通路，减少NF-κB p65磷酸化蛋白表达发挥作用，为临床治疗脓毒症提供实验依据。