野生黑斑蛙与驯食黑斑蛙的舌组织学比较研究

王雪景，陈志男，陈佳艳，黄 镇，符 文，彭亮跃，刘锦辉，徐永福，王冬武，肖亚梅，刘文彬*

（1.省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室，湖南师范大学生命科学学院，长沙 410081；2.湖南省水产科学研究所，长沙 410153）

黑斑蛙（Rananigromaculata）是蛙科、侧褶蛙属、喜群居的两栖动物。其味道鲜美，营养价值极高，深受广大消费者喜爱［1］。近年来，由于工农业污染及对野生黑斑蛙的滥捕滥杀，黑斑蛙类的天然资源锐减，成为了红色名录上的濒危物种。为了满足消费者需求，全国各地陆续开展了黑斑蛙的人工驯养与生态养殖，而野生黑斑蛙的食性较广，主要是以昆虫纲为主。根据大量试验，在人工诱导下建立条件反射，可改变其食性，顺利取食人工饵料，达到驯化的目的。而味觉直接决定了动物对摄取食物的感知和辨别，这种感知首先由舌头决定，从而辨别对食物是接受还是拒绝［2］。同时，舌头对食物在口腔内的运输和吞咽起着非常重要的作用。所以，清楚其舌头的基本结构对于了解野生与驯食黑斑蛙的摄食有着重要的意义。

已有研究表明，哺乳动物的舌表面有一层不同厚度的黏膜［3］，其上的乳头具有机械和味觉功能，其超微结构在不同动物的形态中有所不同，可大体分成四种类型的乳头，即丝状乳头（filiform papilla）、菌状乳头（fungiform papilla）、轮廓乳头（circumvallate papilla）和叶状乳头（foliate papilla）［4-6］。丝状乳头厚，分布于整个舌背表面，并包含小突起。它们有助于控制食物，并在咀嚼过程中增加摩擦［7-8］。菌状乳头数量较少，多位于舌尖与舌缘，散于丝状乳头之间，含有大量的结缔组织和邻近的上皮层，呈“蘑菇”状，内有味蕾。固有层富含毛细血管，使乳头外观呈红色。轮廓乳头位于背表面的尾部区域，不同的物种，其数量、尺寸和形状都不同，一般为7～9个，排列在界沟的前方，呈圆轮状，周围有深沟环绕，沟内有味蕾，尾侧区域的外边缘是叶状结构，通过黏膜内陷相互分离，参与与味觉有关的感觉系统［9-11］。叶状乳头位于舌的侧缘，形成褶状，其数量可能根据每个物种的进化而变化［12］。

上述研究主要揭示的是哺乳动物的舌形态结构，然而对于两栖类（特别是黑斑蛙）缺乏详细组织学特征的报道。因此，本研究以驯食黑斑蛙与野生黑斑蛙为研究对象，从与摄食及消化相关的舌组织入手，采用光学显微技术、透射和扫描电镜技术对其舌组织进行显微和超微结构的比较研究，以期为黑斑蛙的营养物质的吸收和饵料的改良提供试验依据，同时，为黑斑蛙野生资源保护及开发利用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从湖南南县文建特种水产养殖合作社取1龄野生黑斑蛙和人工配合饲料喂养的驯食黑斑蛙各20只（均健康无病，活动状态正常）。野生黑斑蛙体重为（69.9±10.8）g，体长为（10.5±0.8）cm；驯食黑斑蛙体重为（87.4±15.6）g，体长为（11.7±0.4）cm。配合饲料的营养成分组成：水分9.34%、粗蛋白质41.90%、粗脂肪5.78%、粗灰分9.48%。

1.2 主要试验药品和仪器

药品：戊二醛、磷酸缓冲液、冰醋酸、二甲苯、无水乙醇、苦味酸均购买于上海国药集团；锇酸（锇含量1%）购买于上海榕柏生物技术有限公司；蜡块、苏木精、伊红、Epon 812树脂均购买于上海生工生物工程有限公司。仪器：石蜡切片机（LEICA RM2015）、超薄切片机（LEICA UC7）、扫描电镜（ZEISS EVO18）、透射电镜（日立HT7700）。

1.3 石蜡切片

将黑斑蛙捣髓后迅速解剖，取舌组织固定于Bouin氏液中。制成5 μm石蜡切片后，经苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，然后进行组织学观察。具体操作参考本小组发表的论文［13-16］。

1.4 扫描电镜

将黑斑蛙捣髓后迅速解剖，取舌组织固定于2.5%的戊二醛中，2 h后加入1%锇酸固定1 h，丙酮梯度脱水，临界点干燥，喷金，于扫描电镜下观察并拍照。具体操作参考本小组发表的论文［16］。

1.5 透射电镜

将黑斑蛙捣髓后迅速解剖，取舌组织固定于2.5%的戊二醛中，固定2 h后用0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗3次，1%的锇酸固定后用0.1 mol/L的磷酸缓冲液冲洗3次，固定样品经酒精、丙酮梯度脱水，Epon 812树脂包埋，制备超薄切片，透射电镜下观察。具体操作参考本小组发表的论文［17］。

2 结果与分析

2.1 野生黑斑蛙与驯食黑斑蛙舌组织显微结构的比较

通过对舌组织横切面进行HE染色，发现野生黑斑蛙与驯食黑斑蛙二者都有角质化的丝状乳头和菌状乳头。丝状乳头分布在整个舌背表面，并由主乳头（图1中的黑色箭头）和次级乳头（图1中的蓝色箭头）构成。菌状乳头位于舌尖和舌缘，去除上皮后可看到其上皮细胞呈火山状（图1中的红色箭头）。野生和驯食黑斑蛙的舌组织学结构也存在一定的差异：野生黑斑蛙舌表面的丝状乳头相对更加发达，且角质化程度比驯食黑斑蛙更明显，可观察到菌状乳头的角化程度不如丝状乳头。

图1 野生黑斑蛙与驯食黑斑蛙舌组织的显微结构Fig.1 The microscopic structure of tongue tissue of wild Rana nigromaculata and domesticated Rana nigromaculata

2.2 野生黑斑蛙与驯食黑斑蛙舌表面扫描电镜的比较

根据图2中野生黑斑蛙与驯食黑斑蛙舌背面的扫描电镜观察，发现二者乳突背表面不规则，被复层鳞状上皮所覆盖，鳞状上皮形成嵴（图2b、2i中的红色圆圈），表面可见菌状乳头的味觉孔（图2a、2m中的红色箭头），菌状乳头分布于舌尖和舌缘的丝状乳头之间。相邻单元格之间的单元格边距增厚（图2h、2o～2p中的黄色箭头），形成轻微隆起。野生黑斑蛙舌背面的相邻细胞之间的边缘有一条微绒毛带（图2d中的黑色箭头）。图中可观察到叶状乳头（图2e、2o中的紫色箭头），指状的叶状乳头位于舌背侧表面的边缘，被一层非角化的鳞状复层上皮覆盖，每个乳头由若干个薄片组成，组成的薄层被上皮裂隙分开，但是在这些类型的乳头中看不到味蕾。与驯食黑斑蛙相比较来看，野生黑斑蛙舌表面的复层鳞状上皮所覆盖形成的嵴更加的不规则，角质化程度相较于驯食黑斑蛙也更大。

图2 野生黑斑蛙与驯食黑斑蛙舌背面的扫描电子显微结构Fig.2 Scanning electron microstructures of dorsal tongue of wild and domesticated Rana nigromaculata

图3舌截面的扫描电镜分析显示，野生黑斑蛙与驯食黑斑蛙的舌背表面可见丝状乳头和菌状乳头。二者舌背表面丝状乳头最多，或成丝状（图3a～3c中的红色圆圈），或成锥形（图3d～3e中的黑色箭头）。菌状乳头（图3b、3d～3e中的红色箭头）基部比顶端宽，分布于背表面的舌尖和舌缘的丝状乳头之间。野生黑斑蛙的丝状乳头明显比驯食黑斑蛙更发达。在高倍放大图中多见细长的丝状乳头交错成网状，而在驯食黑斑蛙中丝状乳头呈低锥形。而且，野生黑斑蛙成簇的丝状乳头的角化程度不如驯食黑斑蛙中呈低锥形的丝状乳头。丝状乳头分布于舌背侧表面，有助于控制食物，并在咀嚼过程中增加摩擦。野生黑斑蛙食性比驯食黑斑蛙食性更加复杂，所以摄食器官舌头表面的丝状乳头更加长且多。

图3 野生黑斑蛙与驯食黑斑蛙舌截面的扫描电子显微结构Fig.3 Scanning electron microstructures of tongue cross sections of wild and domestic Rana nigromaculata

根据图4中野生黑斑蛙与驯食黑斑蛙舌底面的扫描电镜观察，发现野生黑斑蛙的舌表面在高倍放大图中可见丝状乳头成簇存在（图4中的红色圆圈）。驯食黑斑蛙舌表面的高倍放大的扫描电子显微镜图中可见，乳突背表面不规则，被复层鳞状上皮所覆盖，鳞状上皮形成嵴（图4中的黑色箭头）。菌状乳头分布于舌尖和舌缘的丝状乳头之间，表面可见其味觉孔（图4d中的红色箭头）。野生黑斑蛙和驯食黑斑蛙的背侧上皮与腹侧上皮相比，腹侧上皮薄，无角质化，无乳头。相邻单元格之间的单元格边距有增厚，形成轻微隆起。

图4 野生黑斑蛙与驯食黑斑蛙舌底面的扫描电子显微结构Fig.4 Scanning electron microstructures of undertongue of wild and domesticated Rana nigromaculata

2.3 野生黑斑蛙与驯食黑斑蛙舌组织超微结构的比较

如图5中野生黑斑蛙和驯食黑斑蛙的舌头腺体透射电镜超微照片所示，与舌的背侧上皮相比，腹侧上皮较薄，无角化，无乳头。由于与食物摩擦，舌头磨损更大的背表面的上皮厚而坚硬。舌心由骨骼肌纤维、结缔组织和舌腺组成。肌纤维在三个平面上交叉，通常由结缔组织（图5b中的红色圆圈）隔开。固有层和黏膜下层包含有血管（图5d中左下角的红星）和神经纤维（图5d中的黄色箭头），其厚度较薄。唾液腺局限于舌的后部，由许多浆液腺泡（图5c～5d中的黑色箭头）和黏液腺泡（图5a、5c～5d中的蓝色箭头）组成。小叶内导管（图5a中的红色箭头）周围环绕着薄的结缔组织纤维。细胞间（图5d中白色箭头）存在大量的细胞间连接。上皮浅层细胞中存在无定形碎片。透明角质颗粒（图5a、5d中的红色椭圆）呈不规则或细长状，电子密度高。游离神经末梢被浆液腺泡包围，周围有几个线粒体，中央部分有神经丝。

图5 野生黑斑蛙与驯食黑斑蛙舌头腺体透射电镜超微结构Fig.5 Ultramicrostructure of tongue glands in wild and domesticated Rana nigromaculata by transmission electron microscopy

3 讨论

黑斑蛙俗称青蛙、田鸡，因其肉质细嫩、味道鲜美、低脂肪、高蛋白等优点而被人们喜爱。近年来野生黑斑蛙数量已远不能满足人们的需求，因此，人工驯食养殖逐渐兴起。但要把以昆虫类为主食的野生黑斑蛙成功驯食为以人工配合饲料为食的驯食蛙，首先第一步就是解决食物的摄取问题。而味觉直接决定动物对摄取食物的感知和辨别，动物可以对不同的味道做出不同的反应，最终决定接受还是拒绝。舌头又是一个重要的味觉器官，动物摄食后首先由舌感觉基本的味觉。两栖纲无尾目动物的味觉器官一般被称为味觉盘（taste disc）［18］，黑斑蛙的味觉盘主要位于舌背面的舌中部和舌尖的菌状乳突的顶端，一个菌状乳突仅其顶端具备一个味觉盘，菌状乳突侧壁上皮层中无味觉盘。舌尖上菌状乳头的积聚可能与预先选择食物有关［19］。舌背面的丝状乳突顶端上皮层中主要为黏液细胞，而舌腹面无乳突和味觉盘，上皮层中亦无黏液细胞。这与蛙捕食时，舌后端外翻拉长伸出口外黏捕食物是相符的［20］。舌背面菌状乳突顶端的味觉盘丝状乳和突顶端的黏液细胞分别对猎物的选择和黏捕起一定的作用。

目前对于舌的研究主要集中于哺乳动物的四种舌乳头［21-25］，并且国内外对于黑斑蛙的研究主要集中在对野生黑斑蛙的基础研究、养殖、毒性物质对胚胎或蝌蚪期生长发育的影响和黑斑蛙病害及防治等方面，而对黑斑蛙的舌组织学研究却尚未见报道。因此，本研究从与摄食及消化相关的舌组织入手，采用石蜡切片、扫描电镜和透射电镜对野生和驯食黑斑蛙的组织学进行了较详细的比较研究。

在食肉目中，研究者们对猫、丛林犬、熊、黑背豺、老虎、狮子和波斯豹［26-33］等的舌头进行了研究，确定了其解剖学和组织学特征及区别，发现它们舌背黏膜内衬都有复层鳞状上皮，且舌乳头可分为丝状乳头、菌状乳头、叶状乳头和轮廓乳头，丝状乳头分布于整个舌背表面。这些类型的乳头角质化良好，由固有层结缔组织支撑。一般来说，每个大的丝状乳头周围都有小突起，且具有类似的上皮细胞层和薄的角质化细胞。本试验中的石蜡切片研究表明，野生黑斑蛙与驯食黑斑蛙二者都有角质化的丝状乳头和菌状乳头。丝状乳头分布在整个舌背表面，并由主乳头和次级乳头构成，这与食肉动物有相似之处。另有研究认为，舌头中丝状乳头的二级突起可以扩展表面，使固体和半液体食物黏附到舌头上［34］，并且在一些哺乳动物的舌头中也观察到了这些过程（如骆驼和山羊）［35］。菌状乳头都位于舌尖和舌缘，去除上皮后，菌状乳头的上皮细胞呈火山状，顶部有一个味蕾腔。在本研究中，二者在舌组织学结构上存在一定的差异：野生黑斑蛙舌表面的丝状乳头相对更加发达，且角质化程度比驯食黑斑蛙更明显。这与野生黑斑蛙的食性是相关的。野生黑斑蛙相较与驯食黑斑蛙来说食性更加复杂，多取食活动的昆虫等，因此，这可能与野生黑斑蛙对食物选择性的弱倾向有关。舌体中部也可见圆柱形丝状乳头。在食肉目的舌头研究中也出现了有助于吞咽咀嚼食物团的圆柱形丝状乳头，舌后乳头变为圆锥形，覆盖整个舌根后部，上皮细胞增厚，舌前部基底上皮细胞高度相对更厚。所以可推测，作为摄食器官的舌头，其上有助于抓食的结构更加发达，而丝状乳头结构厚且分布于整个舌背侧表面，它们有助于控制食物，并在咀嚼过程中增加摩擦。

许多研究通过扫描电镜观察啮齿动物，发现小鼠、豚鼠、美洲海狸等不同物种的舌乳头的表面和结缔组织核心的三维结构有不同的形状，且这些啮齿类舌乳头的类型在分类、形状和味蕾的形态特征上表现出一定的共性和差异［7，36-40］。它们在中部和尾部区域可以发现细长的多丝乳头，去除上皮后，丝状乳头顶端呈锥形，基部比顶端宽。大鼠的乳头间区有细束，这与其他丝状乳头不同，且去除上皮后可观察到火山状的菌状乳头。本试验通过扫描电镜超微结构的比较观察，发现野生和驯食黑斑蛙都可以观察到位于背表面尾部区域舌侧的大尺寸轮廓乳头，以及由上皮褶皱组成的叶状乳头，并也有平行的凹槽分隔开，同时可观察到舌中部丝状乳头由较大的主乳头和多根次级乳头构成，这些结构与啮齿动物基本相似。但二者的亚显微结构也存在一定的差异：野生黑斑蛙舌表面的丝状乳头更加发达，上皮细胞增厚，舌前部基底上皮细胞更厚，角质化程度比驯食黑斑蛙更大。这可能是因为，吞咽过程中舌头和食物之间的摩擦力更大，因此角质化程度也更大。总之，动物丝状乳头的类型和分布差异与年龄、食物和喂养以及咀嚼模式有关。

也有学者在偶蹄目中研究发现，在奶牛、黑犀牛、印度羚、大角野绵羊、单峰骆驼、河马等［41-54］动物舌表面的三维结构中，不同物种舌背表面乳头的形态分布特征有共同点也有差异性。它们的真菌状乳头呈圆形，舌体的丝状乳头由一个主乳头组成，与舌尖的丝状乳头相比较大。轮廓乳头呈扁平椭圆形，乳头周围有半圆沟槽。大多舌核由骨骼肌纤维、结缔组织和舌腺组成，肌纤维由结缔组织分开，固有层和黏膜下层是含有血管和神经的致密结缔组织。唾液腺局限于舌头的后部，由许多浆液细胞和少量黏液细胞组成，小叶内导管内覆鳞状上皮细胞。本试验通过透射电镜超微结构的比较观察发现，野生和驯食黑斑蛙的舌心也基本由骨骼肌纤维、结缔组织和舌腺组成。肌纤维在三个平面上交叉，由结缔组织隔开，固有层和黏膜下层厚度较薄，包含有血管和神经纤维。唾液腺由许多浆液细胞和黏液细胞组成。黏液细胞已被证明有助于吞咽干食物，浆液细胞可能在非舌味蕾的味觉机制中发挥作用［32］。

综上所述，本研究结果既丰富了黑斑蛙乃至两栖类动物舌组织学结构的研究，同时又可为驯食黑斑蛙的人工配合饲料的改进及野生黑斑蛙种质资源的保护提供科学依据。