猪细小病毒基因工程亚单位疫苗免疫程序制定

丁国伟，李甜甜，徐萍，潘晨，王设市，魏荣荣，荣雪路，范娟

(扬州优邦生物药品有限公司，江苏 扬州 225008)

猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)属于细小病毒科细小病毒属，病毒粒子为二十面体等轴对称，有2～3 个衣壳蛋白，32 个壳粒，呈圆形，无囊膜，直径18～26 nm；病毒核酸为单股DNA，大小为5 kb。PPV 具有血凝特性，可凝集豚鼠、小鼠、人、猴和鸡的红细胞。PPV 只有一个血清型，目前已经有许多PPV 分离株，按照其致病性和组织嗜性可分为5 个类型[1]，包括弱毒株、强毒株、皮炎型、肠炎型和呼吸道型。其中，PPV 弱毒株(如PPV NADL-2 株) 为非致病性毒株，怀孕母猪感染后不能通过胎盘感染胎儿[2]。PPV 强毒株(如PPV NADL-8 株) 可引起感染母猪发生病毒血症，并能穿过胎盘屏障，使胎儿致病或致死[2-4]。PPV 皮炎型毒株(如 PPV Kresse 株)能引起皮炎，且使免疫不完全的胎儿致死，具有高致病性[5-6]。猪细小病毒具有稳定的结构，能抗乙醚、氯仿等脂溶剂，对酸、碱抵抗力强，对高温不敏感，是一种极难消毒处理的病毒。

猪细小病毒病是由PPV 引起的一种母猪繁殖障碍(reproductive disorder) 病，发病母猪常表现为怀孕母猪发生流产、死产、胚胎死亡和胎儿木乃伊化，而母猪本身并不表现临床症状，其他猪感染后也无明显的临床症状[7]。本病一般呈地方性流行或散发，有时也呈大面积暴发，多见于猪群初次感染，即初产母猪临床症状明显。自1966 年发现第1 例猪细小病毒病以来，截止到1995 底，据不完全统计，世界上47 个国家相继报道过此病，这些国家遍布世界，由此可以推测PPV 可能普遍存在于世界上各国家，只是发现早晚的问题。1983年，我国首次在上海分离到PPV 后，相继在四川、黑龙江、天津、湖北等地也分离到该病毒。本病常见于初产母猪，其流行具有以下几个特点：⑴混合感染。PPV 可以和多种病毒发生混合感染，包括猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、猪圆环病毒 2型(porcine circovirus type 2，PCV2)、猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV) 以及猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV) 等。此外，PPV还可以与某些细菌、寄生虫等混合感染，如沙门菌、大肠杆菌和附红细胞体原虫等。⑵持续感染。PPV 主要通过呼吸道和消化道传播，易感猪通过接触发病猪的分泌物、排泄物及污染的器具等感染本病，猪场一旦发病将连续几年出现母猪繁殖障碍。PPV 的传染源比较广泛，发病猪和带毒猪是主要传染源，妊娠母猪感染后可通过胎盘将该病毒传给胎儿，子宫内感染的胎儿可带毒至少9 周。PPV 也可感染公猪，配种时易传染给母猪。PPV 既可水平传播，又可垂直传播，使被感染猪群表现为持续感染。⑶流行范围广且危害未减。流行病学调查表明，PPV 的流行范围广，在我国很多地方的猪群中流行。PPV 也是导致妊娠母猪的胚胎和胎儿死亡的主要病原体，感染后主要危害早期的胎儿[8]。近年来，猪细小病毒病的发病率呈上升趋势，给世界养猪业造成了巨大的损失。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗

PPs01、PPs02、PPs03 3 批次猪细小病毒杆状病毒载体灭活疫苗(PPV rPP03 株)，由扬州优邦实验室制备。

1.1.2 试验猪

试验所用的后备母猪、经产母猪、种公猪均来自镇江丹徒云立牧业、扬州久旺畜牧养殖场、内蒙古呼和浩特市土左旗种猪场、赛罕区种猪场。

1.1.3 其他耗材

1.0%豚鼠红细胞悬液、25%高岭土、猪细小病毒凝集抗原均由扬州优邦实验室制备。

1.2 方法

1.2.1 后备母猪的免疫

⑴免疫一次后备母猪：5～6 月龄后备母猪12 头，随机分为3 组，每组4 头，分别颈部肌内免疫实验室试制的3 批次疫苗，1 mL/ 头，另2 头后备母猪作为空白对照。分别于免疫前、免疫后14 d、28 d、2 个 月、3 个 月、4 个 月、5 个 月、6 个 月采血，通过血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)试验检测PPV 的血清抗体。

⑵免疫二次后备母猪：5～6 月龄后备母猪12 头，随机分为3 组，每组4 头，分别颈部肌内免疫实验室试制的3 批次疫苗，1 mL/ 头，另2 头后备母猪作为空白对照。首次免疫14 d 后，以相同的剂量和方法加强免疫一次。分别于二次免疫前、二次免疫后14 d、28 d、2 个月、3 个月、4 个月、5 个月、6 个月、7 个月、8 个月采血，通过HI 试验检测PPV 的血清抗体。

1.2.2 经产母猪的免疫

未怀孕的经产母猪9 头，随机分为3 组，每组3 头，分别颈部肌内免疫实验室试制的3批次疫苗，1 mL/头，另2 头经产母猪作为空白对照。分别于免疫前、免疫后14 d、28 d、2 个月、3 个月、4 个月、5 个月、6 个月、7个月、8 个月采血，通过HI 试验检测PPV 的血清抗体。

1.2.3 种公猪的免疫

4～6 月龄的种公猪9 头，随机分为3 组，每组3 头，分别颈部肌内免疫实验室试制的3 批次疫苗，1 mL/ 头，另2 头种公猪作为对照。分别于免疫前、免疫后14 d、28 d、2 个月、3 个月、4 个月、5 个月、6 个月、7 个月、8 个月采血，通过HI 试验检测PPV的血清抗体。

2 结果

2.1 后备母猪免疫后的PPV 抗体消长规律

后备母猪免疫后PPV 抗体消长结果见图1。由图1 可知，初产母猪在5～6 月龄时PPV 母源抗体基本消失，疫苗二次免疫组母猪的抗体水平较一次免疫组母猪的抗体水平峰值高，且持续时间较长。一次免疫组母猪免疫后28 d 的PPV 血清抗体水平上升至几何平均值为6.5log2～7.5log2，免疫后2～3 个月为抗体水平高峰期，免疫后4 个月抗体水平有所下降，免疫后6 个月PPV 血清抗体几何平均值降至5.5log2～6.5log2，每头后备母猪的抗体几何平均值均不低于1 ∶32。二次免疫组，二次免疫后14 d，PPV 抗体含量即达到较高水平，至免疫后3 个月抗体水平达到最高，三组抗体几何平均值为9.5log2～10.0log2，持续至免疫后6 个月时，抗体水平降低较为明显，抗体几何平均值为6.75log2～7.25log2；至免疫后7 个月，各组抗体几何平均值仍维持在6log2以上，至免疫后8 个月时，部分猪PPV血清抗体降至5log2。

2.2 经产母猪免疫后的PPV 抗体消长规律

经产母猪免疫后的PPV 抗体消长结果见图2。

由图2 可知，经产母猪免疫接种前的基础抗体水平为5log2～7log2(1 ∶32～1 ∶128)，免疫14 d 后PPV 抗体水平上升缓慢，免疫28 d 后PPV 抗体水平上升明显，免疫后2～4个月为PPV 抗体水平高峰期，血清HI 抗体效价可达8log2～11log2(1 ∶256～1 ∶2 048)，免疫后6～8 个月逐渐下降，免疫后8 个月时3组抗体水平几何平均值降至6.0log2～6.3log2，个别猪降至1 ∶32。

2.3 种公猪免疫后的PPV 抗体消长规律

种公猪免疫后的PPV 抗体消长结果见图3。由图3 可知，4～6 月龄的种公猪PPV 母源抗体基本消失，疫苗免疫后28 d 抗体水平上升至1 ∶64 以上，免疫后2～4 个月为抗体水平高峰期，各组血清抗体水平几何平均值最高可达9.3log2，免疫后5 个月抗体水平缓慢下降，至免疫后6 个月时，各组抗体水平几何平均值为6.3log2～6.7log2，免疫后7 个月时，个别猪抗体水平降至5log2(1 ∶32)。

3 讨论

后备母猪免疫组二次的抗体水平峰值较免疫一次组的抗体水平峰值高，且持续时间较长。免疫一次组母猪免疫后28 d，PPV 抗体水平开始缓慢上升，免疫后2～3 个月为PPV抗体水平高峰期，随后开始缓慢下降，至免疫后6 个月时血清抗体水平几何平均值降至5.5log2～6.5log2；免疫二次组，二次免疫后PPV 抗体水平快速上升，免疫后2～5 个月为抗体水平高峰期，抗体效价比免疫一次组母猪的高1～2 个滴度，免疫后7 个月，各组母猪的PPV 抗体水平几何平均值仍维持在6log2以上。

经产母猪PPV 抗体消长趋势同后备母猪免疫二次组的，免疫后14 d PPV 血清抗体水平几何平均值不低于1 ∶64，免疫后28 d PPV抗体水平明显上升，免疫后2～4 个月为抗体水平高峰期，免疫后6～8 个月抗体水平逐渐下降，免疫后8 个月时3 组母猪的PPV 抗体水平几何平均值降至6.0log2～6.3log2，个别母猪降至1 ∶32。

种公猪免疫后28 d PPV 抗体水平上升至1 ∶64 以上，免疫后2～4 个月为抗体水平高峰期，各组母猪PPV 血清抗体水平几何平均值为8.0log2～9.3log2，免疫后5 个月开始抗体水平缓慢下降，至免疫后6 个月时，各组母猪抗体水平几何平均值为6.3log2～6.7log2，免疫后7 个月时，个别母猪抗体水平降至5log2(1 ∶32)。

4 结论

上述结果显示，各组母猪免疫后除后备母猪免疫一次外，其他各组母猪在免疫后7～8 个月时，PPV 抗体水平仍可维持在5log2～6log2以上，由《最小免疫剂量与抗体攻毒保护相关性》报告可知，PPV 的血清抗体水平不低于1 ∶32 时，可使母猪产生100%的保护效力，因此综合上述结果，并考虑到临床实际应用中有许多不确定性因素，可能导致免疫效果无法同实验室免疫效果相同，暂制定不同用途猪的免疫程序如下：后备母猪5～6 月龄免疫1 次，2～3 周加强免疫1 次；经产母猪于配种前2～4 周免疫1 次，种公猪每6 个月免疫1 次。