针刺“百会”透“曲鬓”通过miR-34a-5p/KLF4信号通路治疗脑出血大鼠的机制研究

李 丹，朱 曦，邓晓丰，李 龙

(1.黑龙江神志医院，黑龙江 哈尔滨 150036；2.复旦大学，上海 200433；3.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029)

脑出血(Intracerebral hemorage，ICH)作为一种非创伤性的因脑内血管破裂导致血液聚积在脑实质内的疾病，是一种以病情凶险、病死率高为特点的神经系统损伤[1]。流行病学研究发现，我国的脑出血发病率为0.045%，患病率为0.215%，死亡率为0.060%，而3个月致死致残率则高达40.4%～59.5%[2]。同时脑出血康复后仍有很高的复发风险，且其致残的严重程度不一，大多数表现为行动和意识障碍[3]。高血压、睡眠呼吸暂停综合征、年龄、性别与抗凝药物使用甚至医疗保险不健全等都可能成为引起脑出血的危险因素[4]。目前内科与外科均有一些治疗脑出血的方法，但目前尚未明确哪一种方法能够有效改善脑出血的不良预后。阐明脑出血损伤的机制，研究有效的治疗方法，已成为这一疾病研究需要尽快解决的首要问题。

随着对脑出血治疗机理研究的不断深化，研究发现，miR-34a-5p在脑卒中患者血液中的表达上调[5]，在脑出血大鼠脑组织中，KLF4的表达显著降低。近年有研究发现“百会”透“针刺”疗法能够对大鼠神经功能学评分产生正向影响[6]。在血管内皮中过度表达的miR-34a-5p还会破坏血脑屏障，使线粒体功能发生障碍[7]。作为一种锌指蛋白，KLF4能够通过易位表达促进血管内皮生长因子表达，从而促进血管新生[6]。在脑组织中，高表达的KLF4还可抑制神经母细胞瘤细胞的增殖与侵袭[8]、调控上皮细胞-间叶细胞转化[9]和使得支持细胞向神经干细胞分化[10]等，可在多种中枢神经系统疾病中产生影响。

近年来的研究发现，针刺在治疗脑出血这一损伤时具有积极作用[11-12]，但其治疗脑出血的机制尚不明确，亟需进一步研究。“百会”透“曲鬓”针刺疗法的作用已得到众多实验的证实[13-15]，但该疗法的具体作用机理还没有阐释明确。现有研究大都从细胞因子表达层面上进行研究[16-17]，但其对于minRNA及mRNA表达的影响尚需进一步阐释。实验发现“百会”透“曲鬓”针刺疗法上调了KLF4表达水平，下调了miR-34a-5p的表达水平，推测调节miR-34a-5p/KLF4信号通路是“百会”透“曲鬓”针刺疗法能够减轻脑出血后神经损伤的途径。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选取60只清洁级健康的雄性SD大鼠，实验动物由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，使用许可证号：SCXK(京)2019-0008，3月龄，体质量250～300 g，大鼠全部采用分笼饲养于温度(25±1)℃、湿度45%～55%和明暗周期12 h/12 h循环环境下，自由饮食。按随机数字表法将SD大鼠随机均分5组，每组又随机分1 d和7 d两个时间点。本实验经过北京中医药大学学术委员会实验动物伦理分委员会审批(编号No:BUVM-4-2021122002-4106)。

1.2 主要仪器及试剂

1.2.1 仪器 NW10LVF型超纯水系统(香港,Heal Force);H-2050R型超速冷冻离心机(长沙,湖南湘仪);Proline型微量移液器(苏州,BIOHIT);DZF-6050型真空干燥箱(上海,SYSBERY);NANO 2000型紫外分光光度计(美国,Thermo);PVDF膜(美国,Thermo Fisher Scientific公司);Exicycler 96型荧光定量PCR仪(韩国,BIONEER);WD-9405B型水平摇床、DYY-7C型电泳仪、WD-9413B型凝胶成像系统、DYCZ-40D型转移槽和DYCZ-24DN型双垂直蛋白电泳仪(北京,北京六一);DH36001B型电热恒温培养箱(天津,天津泰斯特);ELX-800型酶标仪(美国,BIOTEK)。

1.2.2 试剂 TRIpure、Super M-MLV 反转录酶、2×Power Taq PCR MasterMix及RNase inhibitor(北京,BioTeke)；SYBR Green(北京,Solarbio);ECL发光液(中国,7 Sea biotech);预染蛋白分子量标准(加拿大,Fermentas);BSA(中国,Biosharp);RIPA裂解液(强)、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、30% Acr-Bis(29:1)和SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(中国,beyotime);KLF4 antibody、羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG和内参抗体β-actin(中国,Proteintech)等。

1.3 造模及干预方法

1.3.1 ICH模型制作 运用自体血注入尾壳核制取脑出血模型。禁食12 h和禁水6 h后造模。采用自体血注射的方法,根据大鼠的立体定位图谱，向大鼠腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，以俯卧位的形式将大鼠固定在立体定位仪上，随后将定位仪两侧耳杆插入大鼠骨性外耳道，将大鼠门齿定位在门齿孔上，通过调整高度来保证前囟点和人字点处于水平位置。以两耳尖连线中点为标志，进行备皮、消毒和切口，钝性分离皮下骨膜后，将前囟点及冠状缝充分暴露，用立体定位仪定位坐标点(前囟点为中心，右侧3.5 mm，后侧0.2 mm)，用1.0 mm直径钻头钻孔至硬脑膜表面，若落空感停止，但要注意避免穿孔过深，从而损伤脑组织。在对鼠尾进行消毒后，由实验人员在距尾端3 cm处a剪断，这时采血50 μL，将大鼠重新固定在立体定位仪上，以20 μL/min注入自体血，针头刺入深度6 mm，进行5 min留针后缓慢出针。最后在大鼠断尾处进行消毒包扎，在头部抗菌用牙科水泥密封颅骨钻孔，使用碘伏消毒，缝合，防止感染。

1.3.2 大鼠随机分组及干预方法 本研究选用60只清洁级健康雄性SD大鼠，3月龄，体质量约250～300 g，分笼饲养，自由饮食。按体质量将健康雄性大鼠随机平均分为5组，每组6只大鼠，每组再随机分为1 d、7 d两个亚组。

假手术组(Sham)：开皮、钻孔、注射生理盐水和缝合，对大鼠进行每天1次与针刺组相同的捆绑，每次30 min。

模型组(ICH)：复制脑出血模型，建模12 h后对大鼠进行每天1次与针刺组相同的捆绑，每次30 min。

模型+针刺治疗组(ICH+acupuncture)：脑出血造模后12 h给予针刺治疗，每24 h针刺1次。参照《实验动物穴位图谱》进行针刺部位选择，取大鼠百会穴(顶骨正中)、患侧曲鬓穴(眶外缘与外耳口连线的后2/3)。针刺方法:使用由百会向曲鬓穴透刺的方法，针灸针快速刺入并以透刺的手法刺向曲鬓穴，施以捻转速度为200 r/min的快速捻转手法，持续捻转5 min，后间隔5 min，反复操作，共留针30 min。针刺治疗后于脑出血造模后相应时间点分别取材。

模型+针刺治疗+agomir阴性对照组(ICH+acupuncture+agomir-NC)：将购买的miR-34a-5p agomir-NC稀释至终浓度为50 μM，取5 μL联合12.5 μL转染试剂于建模前3 d行侧脑室(前囟后0.8 mm，中缝右1.5 mm，头骨表面以下4.5 mm深)注射。复制脑出血模型，建模12 h后给予针刺治疗，每24 h针刺1次，具体操作方法同模型+针刺治疗组保持一致。

模型+针刺治疗+miR-34a-5p agomir组(ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir)：(将购买的miR-34a-5p agomir稀释至终浓度为50 μM，取5 μL联合12.5 μL转染试剂于建模前3 d行侧脑室(前囟后0.8 mm，中缝右1.5 mm，头骨表面以下4.5 mm深)注射。复制脑出血模型，建模12 h后给予针刺治疗，每24 h针刺1次，具体操作方法同模型+针刺治疗组保持一致。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 Longa神经功能缺损评分 大鼠造模完成，等待大鼠意识清醒后，于建模后1 d、7 d时间点对大鼠进行神经功能测评，采用Zea Longa神经功能评分方法对各组大鼠进行神经功能缺损评分。分为5个等级,0分：正常，无神经功能缺损；1分：病灶对侧前爪不能完全伸展；2分：行走时，大鼠向病灶对侧转圈；3分：行走时，大鼠向病灶对侧倾倒；4分：不能自发行走，存在意识障碍。纳入造模时评分为1～3分的大鼠。

1.4.2 Real-time PCR检测miR-34a-5p和KLF4表达 测定完大鼠Longa评分后，对大鼠腹腔注射200 mg/kg过量戊巴比妥钠处死，运用高纯度总RNA快速提取试剂盒提取小鼠脑部血肿周围中的总RNA，并且运用紫外分光光度计定量分析。运用miR-34a-5p茎环RT引物或相应的引物将分离的RNA转录到相应的cDNA中去，所用相关引物为miR-34a-5p：上游5′-GGACTTGGCAGTGTCTTAGCTG-3′，下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；5S：上游5′-GATCTCGGAAGCTAAGCAGG-3′，下游5′-TGGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；KLF4 mRNA：上游5′-GGAGCCCAAGCCAAAGAGG-3′，下游5′-CGTCCCAGTCACAGTGGTAAGGT-3′；β-肌动蛋白：上游5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3′，下游5′-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3′。miR-34a-5p的反应条件为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，循环40次；KLF4 mRNA的反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，循环40次。运用SYBR Green进行RT-PCR分析，在Exicycler 96系统中检测miR-34a-5p和KLF4 mRNA的表达水平。以5S和β-肌动蛋白为内参照物，使用2△△CT法进行数据统计。

1.4.3 蛋白质印迹分析KLF4表达水平 RIPA裂解缓冲液提取大鼠脑内血肿周围的总蛋白，使用BCA蛋白分析试剂盒进行定量分析。进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白质移到PVDF膜中，之后封闭。孵育一抗(KLF4 antibody 1∶500)，夜间4 ℃过夜；孵育二抗(羊抗兔IgG-HRP 1∶10 000)，37 ℃ 45 min。 在Gel-Pro分析系统中运用荧光试剂盒进行可视化展示。以β-肌动蛋白作为内参照物。

1.5 统计学处理

利用SPSS 19.0统计软件包对本实验数据进行归纳整理，多组之间比较采用单因素方差分析进行统计处理，数据采用均数±标准差来表示，检验水平α=0.05，以P<0.05为差异具有统计学意义。

1.6 不良事件

在实验过程中密切观察大鼠活动情况及生命状态，若大鼠特别痛苦或Longa评分被评为4分，则对大鼠实行安乐死。在本研究进行过程中，未观测到预期或未预期的不良事件。

2 结果

2.1 针刺“百会”透“曲鬓”对脑出血大鼠Longa评分的影响

如表1所示，各时间点，与Sham组比较，ICH组脑出血大鼠Longa评分升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，且Sham组脑出血大鼠Longa评分为0。1 d时，与ICH组比较，ICH+acupuncture组脑出血大鼠Longa评分差异无统计学意义(P>0.05)；与ICH+acupuncture+agomir-NC组比较，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir组脑出血大鼠Longa评分差异无统计学意义(P>0.05)。7 d时，与ICH组比较，ICH+acupuncture组脑出血大鼠Longa评分降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与ICH+acupuncture组比较，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir组脑出血大鼠Longa评分升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明miR-34a-5p可能对针刺缓解脑出血造成的神经损伤的疗效会起到抑制作用；与ICH+acupuncture+agomir-NC组比较，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir组脑出血大鼠Longa评分差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠神经功能学评分结果

2.2 针刺“百会”透“曲鬓”对脑出血大鼠血肿周围miR-34a-5p表达的影响

如表2和图1所示，各时间点，与Sham组比较，ICH组脑出血大鼠血肿周围miR-34a-5p表达升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。1 d、7 d两个时间点，与ICH组比较，ICH+acupuncture组脑出血大鼠血肿周围miR-34a-5p表达降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与ICH+acupuncture组比较，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir组脑出血大鼠血肿周围miR-34a-5p表达升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与ICH+acupuncture+agomir-NC组比较，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir组脑出血大鼠血肿周围miR-34a-5p表达升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。

表2 各组脑出血大鼠血肿周围miR-34a-5p水平

图1 miR-34a-5p溶解曲线及扩增曲线图

2.3 针刺“百会”透“曲鬓”对脑出血大鼠血肿周围KLF4 mRNA水平的影响

如表3和图2所示，与Sham组比较，ICH组脑出血大鼠血肿周围KLF4 mRNA表达降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。1 d、7 d两个时间点，与ICH组比较，ICH+acupuncture组脑出血大鼠血肿周围KLF4 mRNA表达升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与ICH+acupuncture组比较，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir组脑出血大鼠血肿周围KLF4 mRNA表达降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与ICH+acupuncture+agomir-NC组比较，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir组脑出血大鼠血肿周围KLF4 mRNA表达降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。

表3 各组脑出血大鼠血肿周围KLF4 mRNA水平比较

图2 KLF4 mRNA溶解曲线及扩增曲线图

2.4 针刺“百会”透“曲鬓”对脑出血大鼠血肿周围KLF4蛋白水平的影响

如表4、图3所示，与Sham组比较，ICH组脑出血大鼠血肿周围KLF4蛋白水平降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。1 d、7 d两个时间点，与ICH组比较，ICH+acupuncture组脑出血大鼠血肿周围KLF4蛋白水平升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与ICH+acupuncture组比较，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir组脑出血大鼠血肿周围KLF4 蛋白水平降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与ICH+acupuncture+agomir-NC组比较，ICH+acupuncture+miR-34a-5p agomir组脑出血大鼠血肿周围KLF4蛋白水平降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

针刺疗法是中医学的重要外治方法，是目前针对治疗脑出血疾病的热点话题。现有研究表明，针刺作为脑出血患者的辅助治疗时，不仅具有良好的治疗安全性，可以减少长期使用药物对人体的刺激，保护神经功能，抑制全身的炎性反应，优化脑血流动力学状态[18]。在本课题组的前期研究中，针刺能够通过调控脑组织内神经细胞生长因子、巢蛋白[19]，碱性成纤维细胞生长因子[20]，达到促进组织修复并抑制细胞凋亡的效果[21]。

表4 各组脑出血大鼠血肿周围KLF4蛋白水平

图3 各组脑出血大鼠血肿周围KLF4蛋白表达

在本课题组的预实验中发现，KLF4在ICH大鼠脑组织中含量显著下降，而miR-34a-5p的表达含量则显著上升。本研究旨在明确针刺对于改善脑出血预后的有效性，探究miR-34a-5p对脑出血疾病发展及预后的影响。探讨miR-34a-5p对KLF4的调节作用，了解头针治疗对miR-34a-5p和KLF4的影响，为针刺治疗ICH提供新的理论。

在最近有关miR-34a-5p以及KLF4的研究中，发现miR-34a-5p在缺血性中风患者的血液中表达升高[22]，且在脑出血大鼠血肿周围表达升高，过表达的miR-34a-5p则会引起神经元的凋亡，同时加重血肿周围的形态学改变[23]，这表明miR-34a-5p的过表达可能会引起脑出血后损伤加重；KLF4则在微血管内皮中能够抑制细胞凋亡和炎性反应[24]，过表达的KLF4能够调节脑梗死后紧密蛋白的表达[25]，对缺血性脑卒中引起的脑神经损伤起到保护作用。除去对于神经元的作用外，KLF4也可以在促进血管新生上发挥积极作用[26]，赵松耀则在其临床观察中发现，脑梗死预后不良的患者较脑梗死预后良好的患者外周血液中KLF4 mRNA表达降低，且KLF4 mRNA表达的情况与溶栓效果成正相关，可以作为评估溶栓效果的指标[27]。相关文献证实了KLF4的3’-UTR区可以同miR-34a-5p结合，且存在靶向关系[28]，miR-34a-5p很可能是通过靶向抑制KLF4，使得KLF4对脑血管及神经组织的保护作用下降，进而抑制针刺减轻脑出血损伤的能力。

本研究分为假手术组、模型组、模型+针刺治疗组、模型+针刺治疗+agomir阴性对照组与模型+针刺治疗+miR-34a-5p agomir组5组，使用Longa评分评定大鼠神经功能缺损情况，实验发现“百会”透“曲鬓”针刺疗法能够降低大鼠Longa评分，改善大鼠神经功能损伤的情况，但miR-34a-5p能够抑制针刺对损伤的治疗效果。同时对脑出血大鼠血肿周围miR-34a-5p、KLF4 mRNA水平与KLF4蛋白表达进行了测定，发现针刺“百会”透“曲鬓”能够下调脑出血大鼠血肿周围miR-34a-5的表达，上调KLF4 mRNA水平与KLF4蛋白表达。笔者发现miR-34a-5p表达水平与KLF4的mRNA和蛋白表达趋势相反，并且KLF4的mRNA和蛋白水平随着miR-34a-5p的过度表达而降低，这提示KLF4应当是miR-34a-5p的靶点之一，也是针刺“百会”透“曲鬓”减轻脑出血大鼠神经损害的靶点之一。

综上所述，此研究验证了miR-34a-5p/KLF4信号通路是针刺“百会”透“曲鬓”减轻脑出血损伤的靶点之一。“百会”透“曲鬓”针刺可以降低脑出血大鼠Longa评分，抑制miR-34a-5p表达，促进KLF4 mRNA表达，促进KLF4蛋白表达，减轻脑出血后神经损害，为今后针刺“百会”透“曲鬓”在脑出血疾病方面提供了理论和实验基础。