新生儿胆道闭锁发病机制的研究进展

李欣 张艳兵 房丽丽

胆道闭锁（BA）目前仍然是小儿外科中最严重的肝胆系统疾病之一，且其治疗效果不佳已达成共识。BA 累及肝内外胆管，虽然肝门-空肠吻合术（Kasai 手术）可以恢复部分胆汁引流，但是肝内胆汁淤积和肝纤维化的程度在术后可能会持续进展。肝移植技术的应用对于BA 的治疗具有重大意义，使得许多BA 晚期发生肝功能衰竭的BA 患儿通过肝移植手术获得长期生存的机会。目前，Kasai 术后综合治疗和儿童肝移植的发展使得BA 术后10 年的总生存率已达到90%[1]。但新生儿发生BA 的发病机制尚不明确，不能在围生期进行筛查或早期诊断，使得BA 在发现时已经出现不同程度胆汁淤积和肝纤维化。因此，探究BA 的发病机制对疾病的预防、早期诊断及治疗具有重要意义。本文对BA 发病机制的最新研究进行阐述。

1 BA的相关基因

BA 是一种肝脏内胆管异常狭窄、阻塞或完全缺失的新生儿胆管疾病。已有研究报道了许多可能导致BA 的病因，包括先天性、围生期和后天性疾病[2]。目前发现多个基因与BA 相关。在一项评估microRNA-499 rs3746444 多态性与BA 风险的关联及其与BA 临床病理特征相关性的研究中，通过使用荧光标记探针在Rotor Gene Real Time PCR System（QIAGEN，GmbH）上进行实时聚合酶链反应（PCR）荧光检测，对所有参与研究的BA 婴儿及健康对照组的miR-499 单核苷酸多态性（SNP）（rs3746444 A>G）进行基因分型。发现miR-499 SNP 基因型与BA 的发生存在关联，变异等位基因G 是BA 的主要等位基因[3]。此外EFEMP1 基因也可能是BA 患者新的易感基因，研究发现EFEMP1 转录物在胆管细胞和门静脉成纤维细胞中具有更高的表达[4]。而肝脏和血清外泌体长链非编码RNA H19（lncRNAH19）也通过影响胆管细胞参与BA 的病程，H19 水平升高导致高迁移率组AT-hook 2（HMGA2）的上调，增强胆道细胞增殖，H19 缺乏通过抑制胆汁酸诱导的S1PR2 和鞘氨醇激酶2（SphK2）的表达和激活来抑制胆管细胞增殖和肝纤维化[5]。Hes1 siRNA 抑制胆管上皮细胞成熟，导致胆管上皮细胞保持未成熟状态，无法形成管状结构[6]。另一段长非编码RNA（lncRNA）膜联蛋白A2 假基因3（ANXA2P3）和膜联蛋白A2（ANXA2）也被发现在BA 患者中表达水平增加，ANXA2P3 和ANXA2 的表达与肝细胞增殖、细胞周期进程及肝细胞凋亡密切相关，并且被认为可能是BA 患者的生物标志物[7]。

2 BA与病毒感染及炎症反应

病毒感染通常被认为是BA 发病机制的始动因素。最常涉及的病毒载体包括疱疹病毒科（巨细胞病毒和Epstein-Barr 病毒）以及呼肠孤病毒科（呼肠孤病毒和轮状病毒）的成员[2]。在BA 和轮状病毒诱导的BA 小鼠的肝脏中，JAG1 和Notch2 的表达显著增加。抑制Notch 通路可改善胆管阻塞并延迟BA 诱导的死亡率。通过抑制Notch 通路，炎症细胞因子[肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-8（IL-8）和白细胞介素-18（IL-18）]的血清水平降低。BA 肝脏中CK19、Sox9 和EpCAM 的表达显著增加，Notch 通路通过促进肝祖细胞向胆管细胞分化而参与BA 的发病机制[8]。信号转导和转录激活因子3（STAT3）是炎症中的关键信号分子，BA 肝组织中的STAT3 和p-STAT3 表达降低。RNA-seq 分析显示BA 中表达STAT3 的中性粒细胞数量减少，同时干扰素相关的抗病毒活性显著增强。STAT3 减少，增强IL-8 和中性粒细胞化学引诱物（C-X-C 基序）配体1（CXCL1）表达并促进干扰素反应性中性粒细胞的积累，导致BA 中的胆管上皮细胞损伤[9]。而miR-155 过表达促进主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ、MHCⅡ、趋化因子（CXC 基序）配体（CXCL）9、CXCL10、单核细胞趋化蛋白1 和IFN-γ 刺激后的CXCL1 的表达，激活JAK2/STAT3，从而增强促炎作用[10]。研究发现BA 患者的肝脏炎症小体基因的表达增加，使用经过改造以灭活携带炎症小体基因的小鼠，IL1R1 或NLRP3 的缺失、自然杀伤细胞的激活以及细胞因子和趋化因子的表达减少，从而防止了上皮损伤和胆管阻塞[11]。高迁移率族框1（HMGB1）作为炎症的晚期介质起着重要作用。和健康对照患者相比，从BA 患儿采集的血清中HMGB1 水平显著升高。BA 患儿血清HMGB1 水平与γ-谷氨酰转移酶水平呈正相关，BA 肝活检组织中HMGB1 信使核糖核酸和蛋白质表达水平上调，血清HMGB1 水平与γ-谷氨酰转移酶水平的相关性可能为BA 的诊断提供新的标志物[12]。

3 BA与免疫反应

越来越多的证据表明免疫反应参与了BA 的发病机制[13]，在恒河猴轮状病毒（RRV）诱导的新生BA 小鼠模型中，缺乏B 细胞的小鼠不会发生BA，并且缺乏B 细胞与T 细胞和巨噬细胞活化的丧失有关。来自BA 小鼠的B 细胞产生了多种与免疫激活相关的先天性和适应性免疫细胞因子，B 细胞分泌的细胞因子可根据T 细胞活化标记分化簇的表达增加来激活T 细胞，增加巨噬细胞浸润和胆道损伤[13]。BA 患者门脉中的淋巴细胞浸润主要表现CD3、CD4和CD8T 细胞显著升高，CD4+T 细胞活化已被证明在BA 中发挥重要作用，评估汇管区CD4+T 细胞亚群的浸润水平的研究发现，BA 患者的肝脏浸润性Th1、Th2、Th17 细胞显著增加，并且与预后呈负相关[14-15]。在小鼠模型中，激活的CD4+淋巴细胞在病毒攻击后第8 天开始出现在肝脏中，而先天免疫反应正在减弱。血浆白细胞介素-17A（IL-17A）水平随着Th17 淋巴细胞和髓样树突细胞的肝积累而上升。分化簇11c（CD11c）树突状细胞的靶向消耗减少了肝脏IL-17A 的产生并改善了肝内胆管损伤。重组IL-17A 在体外诱导新生儿胆管细胞中趋化因子（C-C 基序）配体2 的表达，并且阻断相应的趋化因子（C-C 基序）受体2 减少了体内炎症巨噬细胞向肝脏的募集[16]。而巨噬细胞分泌的TNF-α 及其两个受体TNFR1 和TNFR2 表达增加，减少了细胞凋亡和上皮损伤，抑制T 细胞、肝树突状细胞和NK 淋巴细胞对肝脏的浸润，预防肝外胆管阻塞[17]。

4 BA与胆管增生

Hippo 信号通路参与BA 的发生发展，Yes 相关蛋白（YAP）是Hippo 信号通路的一种效应子，YAP 表达促进了胆管细胞和肝细胞的增殖，与胆管增生、维持胆管细胞的特性至关重要。此外，被确定为YAP 靶基因的ANKRD1 在BA 肝脏中也高表达。YAP 和ANKRD1 在RRV 诱导的BA 小鼠模型中显著上调，可能与BA 的胆管增生有关[18]。TGF-β 信号通路参与BA 的胆管变性过程，异常的转化生长因子-β1（TGF-β1）表达模式与BA期间正常导管板重塑过程中的发育停滞有关，并且可能是上皮-间充质相互作用障碍的基础，发育关键时期的TGF-β 信号传导，尤其是TGF-βRⅡ，可以防止肝外胆道系统的丧失[19]。GATA6 是一种与胆道发育有关的转录因子，BA 患者的肝细胞中GATA6 表达显著上调。BA 肝脏中GATA6 的表达与已知的胆管细胞分化调节因子（JAGGED1、HNF1β 和HNF6）的表达相关，GATA6 是BA 中肝细胞-胆管细胞化生的新标志物和推定的驱动因素。使用细胞转染模型，证明了GATA6 在HepG2 细胞或原代人肝细胞中的强制表达诱导基因表达模式向胆管细胞表型的转变，表明GATA6 在BA 发病机制中的功能作用。GATA6 过表达诱导了几个对早期胆管发育很重要的基因，包括HNF1、HNF6、JAG1和DKK1。GATA6 过表达后基因表达的变化很可能是逐渐发生的，经过更长的培养时间，更多的胆管细胞谱系标志物可以上调[20]。

5 BA与肝纤维化

BA 的纤维化过程涉及胆管损伤和胆管细胞凋亡，胆管细胞通过增加纤维化细胞因子、TGF-β1和血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）的表达来对损伤做出反应。研究发现，BA 中纤维化的快速进展与转录因子SOX9 和肝祖细胞增殖显著相关[21]。在BA 中表达干/ 祖细胞标志物PROMININ-1（PROM1）的上皮-间充质肝祖细胞在胆道纤维化的发展区域内经历扩增，并随后分化为产生胶原蛋白的肌成纤维细胞，促炎性Toll 样受体3（TLR3）激活部分通过TGF-β 通路激活诱导PROM1 和肝祖细胞的肌成纤维细胞分化，以促进BA 相关胆管纤维化[22-23]。研究观察到调节性T 细胞缺乏以及BA 患者外周血和肝脏中Th1、Th2 和Th17 含量增加，Th1 细胞靠近活化的肝星状细胞和BA 肝脏中的纤维化区域，通过IFN-γ/STAT1 途径加速肝星状细胞促纤维化标志物的增殖和分泌，导致细胞外基质沉积和纤维化增加[24]。在活化的肝星状细胞中miR-19b 显著下调，降低的α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白表达，并对肝星状细胞活化产生抑制作用，miR-19b 水平与儿科终末期肝病评分呈负相关[25]。在肝星状细胞中miR-145 的表达显著下调，使内收蛋白3（ADD3）的表达增加，导致BA中的肝纤维化[26]。除此之外，研究发现自分泌运动因子（ATX）具有由溶血磷脂酸活性引起的促纤维化作用。BA 患者和对照的外周血白细胞和肝组织中ATX 表达和ATX 启动子甲基化分析显示，晚期BA 患者的ATX 启动子甲基化水平低于早期BA 患者，ATX 表达显著升高并与BA 患者的ATX 启动子甲基化降低相关。ATX 的启动子低甲基化和过度表达与BA 患者的黄疸状态、肝功能障碍和肝脏僵硬呈负相关。因此，假设外周血中ATX 启动子甲基化和ATX 表达可能作为反映术后BA 中肝纤维化进展的生物标志物。这些发现表明ATX 的启动子低甲基化和过度表达可能在BA 肝纤维化的发病机制中发挥了促进作用[27]。

6 BA与胆汁酸

在BA 肝脏中实质肝细胞（包括肝细胞和胆管细胞）之间的紧密连接和极性复合物受到严重破坏。紧密连接和极性复合物是在维持胆汁屏障和运输方面发挥基本作用的结构。屏障不完整导致胆汁腐蚀上皮和黏膜下组织，从而破坏管腔结构，进一步加重胆汁淤积和肝损伤。研究发现BA 肝脏中胆管细胞和肝细胞的细胞连接和极性复合物的组装存在显著缺陷[28]。这种缺陷的特点是细胞连接蛋白（ZO1、β-catenin、E-cadherin 和claudin-3）的位置紊乱。Cdc42 及其活性形式Cdc42-GTP 在BA 肝脏中显著减少，伴随着上皮连接和细胞极性的破坏与肝细胞中细胞连接和极性复合物的组装受损密切相关，并因胆汁酸腐蚀而加剧[28]。

miRNA 在生物学中发挥重要作用。研究发现BA 小鼠的先天细胞因子和miRNA 的mRNA 表达显著增加，这些细胞因子和miRNA 与胆汁酸转运蛋白/ 核受体（miRNA-22-5p、miRNA-34a-5p 和miRNA-222-3p）相结合，降低胆汁酸转运蛋白和核受体的mRNA 表达。TNF-α 和IL-1β 增加了miRNA 34a-5p 和miRNA 222-3p 的表达，然后这些miRNA 降低了多种胆汁酸转运蛋白和核受体的表达，胆汁酸转运蛋白的丧失会通过胆汁酸滞留增加肝毒性[29]。当胆汁酸与肠上皮中的法尼醇X 受体结合时，会诱导成纤维细胞生长因子（FGF）19 的表达。然后，FGF19 由门静脉流转运，通过细胞外信号调节激酶（ERK）途径导致细胞色素P450、家族7、亚家族A、多肽1（CYP7A1）（胆汁酸生物合成的关键酶）的转录抑制。因此FGF19 在BA 肝细胞中增加且FGF19 通路不会抑制胆汁酸合成[30]。

7 BA与肠道微生物

肠道微生物组在宿主代谢、营养和免疫功能中发挥着重要作用，其多样性和/或组成发生改变，称为生态失调，在疾病状态（包括肝脏疾病）中有所描述。成年期肝肠微生物组的探索主要集中在非酒精性肝病、肝硬化（主要是酒精或病毒性病因）和胆汁淤积性肝病（如原发性硬化性胆管炎），微生物特征与疾病严重程度相关。BA 中肠道微生物群的研究仅限于基于培养的方法，但分子研究正在兴起，虽然处于起步阶段，但强调了肠杆菌科和链球菌的潜在致病作用，以及双歧杆菌的潜在有益作用。细菌易位和肠道微生物组衍生代谢物的产生是肝病发病机制中的关键宿主微生物组机制途径[31]。BA 在微生物组中表现出较低的多样性和显著的结构分离。在微生物分类单元中的门水平上，变形杆菌数量增加，而拟杆菌数量在BA 中减少。在微生物分类单元中的属水平上，链球菌和克雷伯氏菌等几种潜在病原体在BA 中显著增加，而双歧杆菌和几种产丁酸盐细菌的数量下降。在Kasai 手术后，微生物组也受到干扰。BA 的微生物分类单元显示出与肝功能的显著相关性。此外，链球菌/拟杆菌的丰度比在区分BA 与健康对照方面显示出巨大的作用。BA 中肠道胆汁酸显著降低，梭菌与初级/次级胆汁酸的比例呈正相关。肠道微生物生态失调，可能由胆汁酸减少引起，与肝功能有关，对BA 具有良好的诊断潜力[32]。

8 总结

综上所述，BA 的发病机制与多种基因有关，这些基因通过影响胆管细胞及肝细胞的增殖与凋亡参与BA 的病程。病毒感染被认为是BA 的始动环节，炎症反应及免疫反应通过多种炎症细胞因子和免疫细胞因子导致胆管细胞损伤，多个信号通路影响胆管细胞增殖及变性。胆管细胞的损伤和增殖及炎症反应促进肝脏发生肝纤维化。胆汁酸腐蚀上皮和黏膜下组织，破坏管腔结构，进一步加重胆汁淤积和肝损伤。肠道微生物也可能是BA 的潜在发病因素，对此仍需要进一步的研究，明确BA 的发病机制，为如何减少和避免BA 的发生提供新思路。