黄酒酿造中氨基甲酸乙酯控制关键技术研究

黄酒是中国最古老的酒种，被列入重点扶植和发展的酒精饮品之一。 但黄酒的传统酿造采用多菌种、边糖化边发酵的工艺，除了产生乙醇、功能寡肽和大量各类香气物质外，还可能会产生或不慎引入一些不利于人体健康的物质，主要包括氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)、甲醛、生物胺和黄曲霉毒素等。

近年来，江南大学、浙江大学等科研人员针对黄酒酿造中可能产生的氨基甲酸乙酯危害物，深入研究其生成积累规律与阻断机制、功能菌株与酶制剂筛选、全过程减控工艺优化与控制技术集成、检测方法等，为黄酒产业安全生产提供技术支撑。程艳等（2017）以一株黄酒生产工业菌株酿酒酵母XZ-11 为研究对象，采用ARTP 诱变和高通量筛选策略，获得尿素积累量较低菌株，使用实时定量PCR 技术检测氮代谢中尿素代谢和转运相关基因(DUR1,2 和DUR3)的变化，筛选得到一株尿素高效稳定性利用菌株5-11C，其尿素积累量比酿酒酵母XZ-11 降低了50.6%， 实时定量荧光PCR 结果表明， 与尿素代谢和转运相关的基因(DUR1,2 和DUR3)表达量分别提高了3.3 倍和2.2 倍。 方若思等（2021）研究添加鸟氨酸氨甲酰基转移酶对氨基甲酸乙酯及黄酒基础品质的影响， 其采用基因工程手段从短乳杆菌中克隆并大量表达鸟氨酸氨甲酰基转移酶，经Ni-NTA 琼脂糖纯化树脂纯化后添加到黄酒发酵的不同阶段。结果表明：在发酵中期添加的鸟氨酸氨甲酰基转移酶能显著降低氨基甲酸乙酯的质量分数，最高可降低至原质量分数的15%，且对其主要前体物——尿素和瓜氨酸均有影响，同时检测黄酒的理化品质，结果表明游离氨基酸、挥发性风味物质及味觉特性差异不显著， 说明添加鸟氨酸氨甲酰基转移酶未对产品性质产生影响。 中国专利CN202010922066.1 公开了一种降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量的方法， 其提供了一种低产尿素和氨基甲酸乙酯的重组酿酒酵母S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1，此重组酿酒酵母以酿酒酵母Na 为宿主，敲除编码精氨酸酶的基因CAR1， 并且， 高效表达编码脲基酰胺酶的基因DUR1,2 和编码尿素转运蛋白的基因DUR3；使用此重组酿酒酵母生产得到黄酒发酵液中，尿素的质量浓度低至3.0 mg/L，分别较酿酒酵母Na 和出发菌株S. cerevisiae NaDUR1,2-Δcar1 降低了92.1%和43.4%。 CN201911019263.6 公开一种降低黄酒酿造过程中尿素和氨基甲酸乙酯含量的方法， 向黄酒酿造体系中添加酒糟谷蛋白进行发酵， 以原料米质量计，酒糟谷蛋白添加量为0.5~8 g/hg，通过调控酿酒过程中酵母可利用的氮源组成，有效地抑制尿素循环，减少精氨酸的降解，从而减少EC 的形成。 CN201510812131.4 公开了一种可降低黄酒发酵中氨基甲酸乙酯积累的方法， 其使用氮代谢物阻遏效应调控因子改造了的基因工程菌， 其中酵母工程菌消除了调控因子Gln3p 和Gat1p 的核定位调控序列并突变了核定位序列上的磷酸化位点。 在模拟的黄酒发酵体系中，基因工程菌发酵的黄酒中的尿素和氨基甲酸乙酯的含量分别下降了63%和72%， 其中氨基甲酸乙酯质量浓度已经降至55.53 μg/L，同时主要的营养物质和特征性风味物质的含量差异很小。 CN201210125030.6 公开了一种黄酒用氨基甲酸乙酯降解酶产生菌，该发明菌株分类命名为变幻青霉（Penicillium variabile）JN-A525，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.5763。 该菌株的扩增ITS区全序列其氨基酸序列为SEQIDNO:1。 该菌所产的EC 降解酶，最适pH 相对较宽为4.0~6.0，最适温度为50 ℃，该菌产生的酶在模拟黄酒（乙醇15%，EC 3%，pH 4.4）条件下对氨基甲酸乙酯（EC）有相对较强的水解能力， 所产EC 降解酶有在清酒、 黄酒、 米酒等发酵食品中去除已产生的微量EC 与MC 的应用潜力。CN201510218597.1 公开了一种降解尿素和氨基甲酸乙酯的耐乙醇双功能酶及其应用， 该酶是来自于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis 9945A)的脲酶，能够耐受高浓度乙醇的同时高效降解氨基甲酸乙酯。 该发明利用大肠杆菌表达系统BL21(DE3)/pRSFDuet-1，成功实现了具有EC 水解酶活力的脲酶基因的高效表达，以EC 为底物时酶活达到2.93 U/mL，以尿素为底物时酶活达到5.81 U/mL。重组酶在体积分数20%的乙醇中37 ℃保留4 h，以EC 为底物时仍可保留其50%以上的活性。

黄酒中EC 的研究已取得一系列成果， 但如何在不影响黄酒品质的条件下， 高效经济地控制并去除EC，实现大规模工业化应用，提高我国传统发酵食品行业核心竞争力与国际影响力，是行业人员今后研究的重点方向。