基于代谢组学结合GC-MS对薰衣草水提液保护心肌代谢产物提取方法的比较研究

陈和平 李波 姜黎 曾洪燕 袁呈山

【摘要】探讨用代谢组学结合GC-MS法对薰衣草水提液保护心肌代谢产物提取方法的比较研究。通过比对三种不同淬灭方法：60%甲醇/H2O，80%甲醇/H2O，以及80%甲醇/甘油，并以细胞内腺苷酸浓度（ATP、ADP和AMP）为标准来评估淬灭效率；采用气质联用（GC-MS）对沸乙醇提取法（BE），新式提取法（NE），冻融甲醇提取法（FTM）代谢成分的多少进行比较分析。对细胞外代谢物比较显示，NE法可以提取出更多数量的细胞外代谢物。淬灭方法评估结果显示，80%甲醇/甘油的淬灭方法中ATP泄漏量最小。薰衣草水提液浓度及其对心肌功能的保护作用结果显示，60mg/L的薰衣草提取液（LAD）时流出液中CK和LDH的水平显著降低，对心脏有最佳保护作用。大鼠血液成分分析结果显示，经LAD处理后的血液成分在RT（实时12.71min）处有明显不同，C17H23NO2丰度最高。

【关键词】薰衣草水提液；心肌保护作用；淬灭提取；GC-MS；ATP；回收率

A comparative study on the extraction of cardioprotective metabolites from Lavandula augustifolia aqueous extracts based on metabolomics combined with GC-MS

Chen Heping1， Li Bo1， Jiang Li1， Zeng Hongyan2， Yuan Chengshan3

1.The 3rd Afficiated Hospital of Chengdu Medical College（Pidu District Peoples Hospital）Chengdu， Sichuan 611730， China；2.Chengdu Pidu District Hospital of TCM， Chengdu， Sichuan 611730， China；3.State Key Laboratory of Applied Organic Chemistry， Lanzhou University， Lanzhou Gansu 730000， China

【Abstract】 To investigate the comparative study on the extraction of cardioprotective metabolites from the Lavandula augustifolia aqueous extract by metabolomics combined with GC-MS. The quenching efficiency was evaluated by comparing three different quenching methods： 60% methanol/H2O， 80% methanol/H2O， and 80% methanol/glycerol， and using intracellular adenosine concentrations （ATP， ADP， and AMP） as the standard. The results were compared with those of the extracellular metabolites. A comparison of the extracellular metabolites showed that the NE method could extract a higher amount of extracellular metabolites. The evaluation of quenching methods showed that the quenching method with 80% methanol/glycerol had the least amount of ATP leakage. The results of Lavandula augustifolia aqueous extract concentration and its protective effect on myocardial function showed that the levels of CK and LDH in the effluent were significantly reduced at 60 mg/ L of Lavandula augustifolia extract （LAD）， which had the best protective effect on the heart. The results of blood composition analysis in rats showed that the blood composition after LAD treatment was significantly different at RT （12.71 min in real time） with the highest abundance of C17H23NO2.

【Key Words】Lavandula augustifolia； Quenching； extraction； GC-MS； ATP； Recovery

薰衣草作為我国民族药物，主要制成挥发性制剂和传统药物，用于腹胀、头晕、头痛、心悸、气短和关节痛等症状的治疗[1]。早期研究表明，不仅薰衣草精油对大鼠胸主动脉环具有松弛作用，对冠状动脉结扎所致的心肌缺血或心律不齐具有明显保护作用，而且薰衣草水提液中含有保护心脏的有效成分[2]，近年来，随着代谢物谱分析技术的发展，代谢组学平台（综合性代谢物分析）在功能基因组学和系统生物学等领域发挥着越来越重要的作用[3-4]。但目前用于对薰衣草水提液保护心肌代谢产物的研究较少。

1 仪器与试药

气质联用仪GC-MS-QP2010，日本岛津公司生产，薰衣草由宁波芳香码头生物科技有限公司提供，肌酸激酶（CK）试剂盒和乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒均购自中国南京生物工程研究所，2， 3， 5-三苯基氯化四氮唑（TTC）和均匀蓝均购自Sigma-Aldrich公司。

健康雄性大鼠（Wistar， SPF级），体重250～300g，由兰州大学实验动物中心提供。

2 方法与结果

2.1 薰衣草水提液的制备

将100 g薰衣草花放入圆底烧瓶中，加入300 mL蒸馏水浸泡30min，加入200 mL蒸馏水回流1h，过滤收集滤液，重复1次。之后将200 mL蒸馏水再加入回流混合液中0.5h，经三层过滤器收获滤液， 55 ℃真空浓缩，制备薰衣草水提液（LAD）。

2.2 LAD浓度确定

结扎左冠状动脉前降支可引起左心室心肌组织发生缺血再灌注损伤，以左心室发展压（LVDP）为标准确定最有效的薰衣草水提液（LAD）浓度。图1表明当灌注治疗后LAD低于60 μg/mL时，LAD的保护作用随浓度的增加而增加。30min后，I/R损伤后LVDP的恢复率在60 μg/mL浓度下达到最大值。当LAD浓度高于60μg/mL（从70μg/mL到100μg/ mL）时，I/R后LVDP的恢复率下降，这表明高浓度LAD对心脏有副作用，因此60 μg/mL的LAD对心脏有最佳保护作用。

2.3 薰衣草水提液对心肌功能的保护作用

测定薰衣草水提液处理后的大鼠血浆CK和LDH水平评估LAD的心肌保护作用。表1，表2结果表明，I/R组中流出液中CK和LDH的水平显著升高，而经60μg/mL LAD处理后（实验组），流出液中CK和LDH的水平显著降低。这表明60μg/mL LAD对心肌细胞损伤具有保护作用。

2.4 以ATP为标准的淬灭方法评估

淬灭方法参考早期研究报道。在-80℃下用80%甲醇/甘油淬灭血液。淬灭后的样品经7000g，4℃离心5min收集血细胞。将血细胞在4℃下用0.9%生理盐水洗涤2次。不同样品采用相同的淬灭步骤，并用不同的方法进行提取，涡旋混匀后以10000g， -20℃离心5min。根据早期研究，可通过测量ATP的浓度对优化方法的淬灭效率进行评估。采用萤火虫荧光素酶催化的生物化学发光型ATP测定试剂盒，对ATP渗漏进行分析，评估淬灭步骤的稳定性（敏感测定法，Biaffin GmbH & Co KG，德国）。图2表明，在80%甲醇/甘油的淬灭方法中，培养基上清液中可测量的ATP浓度约为85 μM ATP，这是ATP泄漏量最少的实验组，误差线表明所得结果可靠性较高。

采用细胞内腺苷酸浓度（ATP、ADP、AMP）评估淬灭效率，结果见图3，细胞内代谢物的三种淬灭方法获得的结果与上清液中ATP的结果一致。在所有提取方法中，若采用80%甲醇/甘油进行淬灭，则细胞内腺苷酸浓度均较高，误差线表明所得结果可靠性较高。采用80%甲醇/甘油的淬灭方法对ATP和ADP的测定无显著差异。对三种不同样品进行淬灭，结果表明，所有样品中AMP的浓度几乎相等。综上所述，80%甲醇/甘油溶液可用作优化后的淬灭和提取方法。

2.5 提取方法对PCA结果的影响

PCA作为一种无监督方法，已广泛用于比较不同提取方法中样品的代谢谱（Winder等，2008）。PCA结果表明，R2X = 0.796，Q2 = 0.446，其中t[2]的贡献仅为8.87%，这些结果表明这三种提取方法均有良好的重现性。此外，每种提取方法均明显产生了不同的代谢物谱图（图4A）。对PCA负载图（图4B）进一步评估表明，天冬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、棕榈酸酯、磷酸盐是BE的重要代谢产物；AMP、缬氨酸、乳酸、丝氨酸、谷氨酸、苏氨酸、焦谷氨酸是FTM的重要代谢物；亮氨酸和3-磷酸甘油酸酯是NE的重要代谢产物。

2.6 基于OPLS-DS模型的提取方法评估

OPLS-DA作为一种评估验证方法，在本研究中用于代谢组学分析，做为PCA结果的交叉验证和补充。OPLS-DA的Q2表示可预测性和质量，R2表示X和Y的变异性。OPLS-DA的得分图为：R2（X）= 0.849，R2（Y）= 0.997和Q2 = 0.869，表明不同提取方法差异性显著（图5A）。对200个随机排列测试（图5B）通过原始R2和Q2的值高于排列值来验证试验结果。这些结果表明本试验结果具有较高的可信度。

3 讨论

以左心室发展压（LVDP）为标准确定最有效的LAD浓度时，当灌注治疗后LAD低于60μg/mL时，LAD的保护作用随浓度的增加而增加。30min后，I/R损伤后LVDP的恢复率在60 μg/mL浓度下达到最大值。当LAD浓度高于60μg/mL（从70 μg/mL到100 μg/mL）时，I/R后LVDP的恢复率下降，这表明高浓度LAD对心脏有副作用，因此60 mg/L的LAD对心脏有最佳保护作用。

PCA结果表明三种提取方法均有良好的重现性。且每种提取方法均明显产生了不同的代谢物谱图，早期研究指出，不同提取方法对某些代谢产物有较高的提取率，不同的提取方法在对特定代谢产物提取中具有各自的特征。因此，应根据不同实验的目的选择合适的提取方法。

参考文献

[1] 吴霞，刘净，于志斌，等.薰衣草中黄酮类化学成分的研究[J].中国中药杂志，2007（9）：821-823.

[2] 李淑芳，刘继红，尹海燕，等.基于超高效液相色谱-高分辨质谱的非靶向代谢组学技术结合化学计量学对信阳茶树品种差异的研究[J].分析测试学报，2022， 41（2）：149-155.

[3] 杨华，徐金柱，赵丹阳，等.基于GC-MS的绿僵菌代谢组学前處理技术研究[J].华南农业大学学报，2021， 42（5）：69-79.

[4] 王方杰，王婷，罗芳梅，等.基于GC-MS代谢组学技术的杜仲抗骨质疏松作用研究[J].中国中药杂志，2020， 45（22）：5555-5560.