儿童假肥大型肌营养不良临床表现及其相关基因突变的研究

刘晓颖 蔡 斌 甘 露 金诗炜 蒋瑾瑾 周 霖

假肥大型肌营养不良包括杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)和贝氏肌营养不良(Becker muscular dystrophy，BMD)，均是由抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的基因突变所致的X连锁隐性遗传病。DMD常为致死性，临床表现为进行性加重的肌萎缩及肌无力，活产男婴的发病率为1/6 000～1/3 500。患者常在35岁出现明显症状，部分患者20岁左右可因心、肺功能衰竭而死亡[1-2]。BMD患者的临床过程与DMD相似，但病情进展缓慢，预后良好。通过对假肥大型肌营养不良先证者及其家系成员进行DMD基因突变分析，可以协助临床症状不典型患儿的早期诊断。现回顾性分析海军军医大学第一附属医院儿科近年收治的5例假肥大型肌营养不良患儿资料，以加强对该疾病的认识。

1 对象与方法

1.1 研究对象 回顾性分析2009年7月-2020年5月收治于海军军医大学第一附属医院儿科，并确诊为假肥大型肌营养不良的5例患儿资料。患儿监护人均签署知情同意书。

1.2 诊断标准 假肥大型肌营养不良诊断标准参考2016年《中国假肥大型肌营养不良症诊治指南》[1]。患儿临床症状不典型时，若出现不明原因的心肌酶谱指标水平升高、DMD基因突变，亦可支持诊断。

1.3 研究方法 收集5例患儿的一般资料、临床症状、体征(主要为Gower征)、实验室检查结果、肌肉活组织检查(简称活检)结果等。实验室检查的主要指标包括肌酸激酶(creatine kinase, CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme MB, CK-MB)、ALT、AST、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)等，其正常值范围分别为CK 25～200 U/L，CK-MB<25 U/L，ALT<64 U/L，AST<64 U/L， LDH 80～285 U/L。

1.4DMD基因检测方法 采集患儿及其父母外周静脉血2 mL，应用高通量测序进行DMD全基因panel检测。全基因检查长度2.2 Mb，检测内容包括缺失重复及点突变(外显子+内含子)。DMD基因缺失(或重复)的验证采用多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)。

2 结 果

2.1 一般资料分析 纳入的5例假肥大型肌营养不良患儿均为男性，就诊时年龄范围为2 d～8岁，发病年龄范围为1 d～4岁。主要首发表现为双下肢无力、步态不稳、皮肤黄染、肝酶水平升高、新生儿感染等。病例1、3和4均因“肝酶异常”曾至外院就诊，并因误诊只行保肝治疗。病例2的姨表兄曾罹患肌营养不良(具体不详)，余患儿均无家族史。病例4和5因年幼无法配合完成Gower征的体格检查，余3例患儿Gower征均为阳性(+)，并伴有双侧腓肠肌肥大。病例1完成肌肉活检，符合肌营养不良改变，肌电图结果提示肌源性损害导致的肌电改变。见表1。

表1 5例患儿一般资料

2.2 实验室检查结果 5例患儿CK水平均显著升高，伴CK-MB、ALT、AST和LDH水平不同程度的升高。5例患儿CK、CK-MB、ALT、AST、LDH水平分别为(15 810±10 378) U/L、(351.2±212.4) U/L、(202.6±149.9) U/L、(202.4±82.0) U/L、(1 068.0±583.8) U/L，分别为正常上限的 22.9～162.8倍、5.7～28.0倍、0.8～6.9倍、1.6～5.3倍、1.8～6.6倍。分别比较CK升高倍数与CK-MB、ALT、AST和LDH升高倍数，差异均有统计学意义(P=0.000 5或0.001 6)，后4者升高倍数之间两两比较的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表2。

表2 5例患儿实验室检查结果 (U/L)

2.3 基因检测结果 因病例1、2原始基因报告难以获得，本研究详述病例3、4、5基因检测结果，分别见图1、图2、图3。

A 病例3患儿的基因检测结果提示患儿DMD基因49～52号外显子半合子缺失，为自发突变 B 病例3患儿父亲的基因检测结果提示该区域无变异 C 病例3患儿母亲的基因检测结果提示该区域无变异图1 病例3 DMD基因检测结果(图上方序列号为样本编号)

A 病例4患儿的基因检测结果提示患儿DMD基因45号外显子半合子缺失，为自发突变 B 病例4患儿父亲的基因检测结果提示该区域无缺失 C 病例4患儿母亲的基因检测结果提示该区域无缺失图2 病例4 DMD基因检测结果(图上方序列号为样本编号)

4例患儿基因检测提示DMD基因缺失突变，其中自发突变3例，遗传自母亲突变1例，突变位点分别位于48～51号、42～43号、49～52号、45号外显子，既往均见报道，诊断明确。病例5患儿基因检测结果为DMD基因单纯57～59外显子重复突变，为自发突变，既往数据库中未见此突变报道。见表3。

表3 5例患儿基因检测结果

A 病例5患儿MLPA分析结果提示患儿DMD基因57～59号外显子重复变异，为自发突变 B 病例5患儿母亲MLPA分析结果提示无此变异 (横坐标代表探针编号及检测基因-所在外显子；纵坐标代表患者与对照样本荧光信号的比值，红蓝线为基准线，比值高于蓝线为重复，比值低于红线为缺失，荧光信号强度介于0.7～1.3为正常)图3 病例5患儿DMD基因MLPA分析

3 讨 论

假肥大型肌营养不良是由位于Xp21.1的DMD基因缺陷所致的X连锁隐性遗传病。DMD基因突变若影响了其开放阅读框，蛋白质表达则被过早截断，引发DMD；突变若保留了开放阅读框，蛋白质的功能则被部分保留，引发BMD。故与BMD相比，DMD发病早、预后差，更受学者及临床医师的关注。本文仅针对DMD进行讨论。

不同年龄的DMD患儿具有不同的临床特征，诊断要点包括：①X连锁隐性遗传，3～5岁隐袭起病，进行性发展，一般在12岁后出现行走障碍；②可出现双下肢无力、鸭步、Gower征、起蹲困难和腓肠肌肥大等临床表现；③血清CK水平显著升高至正常值的数十倍至上百倍；④肌电图显示肌源性受损；⑤肌肉活检呈典型的肌源性损伤表现，且抗肌萎缩蛋白抗体免疫组织化学染色呈阴性；⑥超声心动图可显示左心室扩大，肌肉MRI提示肌肉水肿和脂肪浸润；⑦DMD基因检测为外显子缺失、重复、微小突变或点突变[1]。在以上7条诊断标准中，年幼儿肌电图和肌肉活检的接受度较差，不易实施；心脏超声和肌肉MRI则不能直接提供诊断线索。故在临床实践中，临床症状和CK检测结果是较易获得的重要的诊断依据。典型特殊姿势和步态包括Gower征，常于患儿幼年发病，但起病隐匿，可无典型临床表现，直至患儿20岁左右因呼吸、心力衰竭就诊，但DMD发展迅速，一经诊断疾病常已达中晚期。因此，在疾病早期，患儿的症状常常被忽视，易误诊、漏诊。

本研究5例患儿均于5岁前起病，病例3、4为婴儿期起病，病例5为新生儿期起病，目前关于婴儿及新生儿起病的报道较少。因年幼患儿在行Gower征检查时不能配合，为诊断带来一定难度，故部分患儿常在发病数年后才得以确诊[3]。在实验室检查方面，患儿除了有典型的CK水平升高，亦伴有心肌酶及肝酶谱指标的异常，临床上易漏诊或误诊为“心肌炎”“肝功能异常”等[4-5]。虽然，AST和ALT水平升高通常提示肝细胞损伤，但肌肉是血清转氨酶的潜在来源。肌营养不良、炎性肌病和代谢性肌病等肌肉疾病可导致血液中肌酸磷酸激酶(CPK)、LDH、ALT和AST水平升高，当伴有肝功能异常、肝酶水平升高时，需考虑到儿童肌肉疾病。当遇到有肝酶水平升高而没有肝病相关临床症状或体征的患儿时，应尽早检测CK水平，有助于肌肉疾病的早期诊断，并避免类似肝活检等不必要的侵入性检查[6-10]。年龄≤3岁的患儿CK水平升高10倍以上时应考虑DMD可能。本研究中5例患儿CK、CK-MB、ALT、AST、LDH水平均升高，但以CK升高尤为显著，提示CK可能是DMD最敏感的实验室检测指标，可用于区别肝脏与心肌损害。新生儿及婴儿期CK水平已显著升高，对于发病早、临床症状隐匿的DMD幼年患儿有重要的诊断意义。

此外，也有国内学者报道1例因肠道感染就诊发现心肌酶水平升高的年长患儿，其无肌肉萎缩、四肢无力、运动障碍、腓肠肌肥大，Gower征呈阴性，拟诊心肌炎并行营养心肌治疗，后经肌电图及基因检测确诊为DMD[6]。DMD患儿在左心室收缩功能下降之前可出现心肌损害，而心肌病是导致DMD患儿死亡的主要原因。本研究中5例患儿的CK-MB水平均明显升高(5.7～28.0倍)，提示疾病早期即可出现CK-MB水平升高，应尽早完善相关检查，对DMD早期随访和干预有一定意义。

抗肌萎缩蛋白是目前所知DMD的唯一致病靶点。DMD基因突变多为大缺失、大重复和点突变[7]。本研究5例患儿中4例为自发基因突变，其中1例系遗传自母亲。基因突变类型80%为缺失突变，突变位点与既往文献报道一致, 基因突变分布于外显子两个热点区域(外显子44～53号和外显子2～20号缺失热区)，与文献报道基本相符。病例5患儿基因检测结果为DMD基因单纯57～59号外显子重复突变，既往鲜见相关报道。曾有研究[8]显示，DMD基因52～62号外显子重复突变，与本研究中重复变异区域有包含关系。自发突变患儿母亲MLPA分析未发现DMD基因外显子拷贝数异常，但不能排除其母亲生殖腺镶嵌体突变的情况存在，亦无法确定变异发生阶段，因此仍建议患儿及其亲属行遗传咨询，以降低再发风险。本研究中5例患儿发病均较早，考虑假肥大型肌营养不良中DMD可能性较大，但DMD基因检测未体现是否破坏“开放阅读框”，因患儿年幼、症状隐匿、体格检查不能配合，仅根据目前的临床表现和实验室检查尚不能完全确诊为DMD，需进一步随访其临床表现以明确其类型。对疑诊假肥大型肌营养不良的患儿进行基因检测，通过其先证者及家系成员进行突变分析，可以发现未经文献及数据库报道的新突变，从而丰富DMD的基因突变谱。

探索DMD理想的生物标志物有助于DMD的诊断。肌特异性微核糖核酸(miRNA)在DMD患者的骨骼肌中富集，且在DMD发病机制中起重要作用，故有学者认为肌特异性miRNA可能成为理想的DMD生物标志物[9]。DMD分子诊断可用于临床诊断。对于依据临床表现和血生物化学检测结果疑诊DMD或BMD的患者，首先选择多重PCR扩增技术(multiplex polymerase chain reaction，mPCR)分析，阴性者行MLPA技术对DMD基因进行缺失及重复突变筛查，对MLPA检测阴性者采用二代测序(NGS)进行检测，如仍未发现异常，进行肌活检蛋白质分析和cDNA分析，这可能是最佳、最经济的基因诊断策略[5,10]。

因目前尚无DMD有效的根治方案，糖皮质激素是唯一被循证医学证实有效且可以延缓病程的药物。近年来，研究者探索治疗DMD的方法包括研发抑制炎症反应、调节钙水平、促进肌肉生长、抗纤维化、促进线粒体功能等针对肌营养不良机制的对症治疗药物，物理治疗(适量的运动训练、应用矫形支具、虚拟现实游戏)，以及基因替代、外显子跳跃、基因编辑等基因治疗方案和干细胞治疗[11-13]。采用基因手段治疗和改善DMD症状、缩短病程、提高生活质量，将为DMD的有效治疗带来希望[14]。准确的患者和携带者基因检测和产前筛查结果，是降低DMD发病率的关键。

综上所述，对于不明原因肝酶、CK-MB水平升高的年幼患儿，应考虑DMD诊断。年幼患儿如不能配合神经系统体格检查，抗拒肌肉活检等有创检查，应尽早完善CK水平检测，并积极进行DMD基因检测，以实现早期诊断、早期治疗，减少漏诊及误诊。