脑出血实验动物模型动物选择与制备方法的研究现状*

苏 男，石素琴，高天一，冯乘铭，蔡志平，徐 晗，方 刚，李 梁

(1.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014040；2.内蒙古巴彦淖尔市医院神经科；3.内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院)

脑出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血，占据全部脑卒中疾病的20 %～30 %，脑出血急性期死亡率高达30 %～40 %。脑出血发病年龄趋于年轻化，严重危害了人们的身心健康[1]。脑出血发病的原因有很多，主要和脑血管的病变有关，同时和高血脂、糖尿病、高血压、血管的老化、吸烟等因素密切相关，是脑血管类疾病中发病急、致死、致残率高的一类脑血管疾病。脑出血的患者往往由于情绪激动、剧烈体力活动时突然发病，早期死亡率高，幸存者中多数留有不同程度的运动障碍、认知障碍、语言吞咽障碍等后遗症，严重影响患者的生活质量[2]。但目前临床上并没有很好的诊疗方法医治此病[3-4]。临床上针对脑出血虽然有很多的治疗方案，大多以外科手术和内科保守治疗为主，无论采用何种治疗方法，大多数病人经治疗后最终会遗留有不同程度的神经功能障碍[5]。为了找到更好地治疗脑出血的方法，研究者采用了不同的动物模型进行脑出血实验，但每种模型都有自身的优缺点，没有单一的模型可以完全符合人类脑出血所带来的组织生理上和病理上的变化过程，根据相关文献的记载[6-10]，目前常用的脑出血的动物模型主要包括自体血注入脑出血模型、胶原酶注射脑出血模型、微球囊充盈脑出血模型、自发性(高血压性)脑出血模型等4大类脑出血动物模型[11]。本文将重点从以上4个方法入手阐述脑出血动物模型的发展过程，概述其发展及运用情况。

1 脑出血模型的动物选择

实验室动物模型的种类有很多种，常用的有啮齿类、鱼类、灵长类等，研究人员根据所要研究的不同方面选择适合的受试动物。在脑出血动物模型的选择上，有文献记载研究者做了不同种类动物模型的制作，包括灵长类脑出血动物模型、犬类脑出血动物模型、猪脑出血动物模型、兔脑出血动物模型、啮齿类大、小鼠脑出血模型等[12]。

1.1灵长类动物模型 在早期研究者曾选择灵长类动物制作脑出血动物模型[5]，其优点是灵长类动物更近似于人类的生理和身体构造，黑猩猩等灵长类动物有90 %的DNA和人类相同，可以更好地模拟脑出血时人体的各种生理病理改变[12]。有学者分别选择长尾黑颚猴和食蟹猴作为受试动物，将右侧股动脉的自体血注入到猴子的大脑内，在实验后12 h内，受试动物都表现出了感觉系统的损害现象，同时出现神经功能受损症状，实验数据适用于观察临床脑出血病人神经受损后的恢复状况[13-14]。灵长类动物作为受试动物制作脑出血动物模型，虽然可以获得更加符合临床的实验数据，但由于实验动物价格昂贵，获取困难，且在伦理上存在一定的争议，所以无法大规模地应用于临床试验中，样本量有限也限制了此类动物应用于大样本的临床试验，所以寻找一类成本小，可大样本量应用的动物模型显得尤其重要。

1.2犬类动物模型 犬类脑出血动物模型的应用研究最早开始于1963年Whisnant等[15]采用自体血注入脑基底核和深层白质中，使之产生不同体积的血肿。经过研究的不断改进，Steiner等[16]第一次对犬类受试动物进行了自体血注入并成功开展了研究。An等[17]采用胶原酶注射法在动物体内形成脑出血，可以观察MRI上脑出血随时间变化的图像改变，但由于注射剂量太大，所以没有大规模投入使用。但在犬类动物脑出血模型的制备中，引用的超声波引导下穿刺出血是不同于其他种类动物模型的一种新的造模方法，Zhou等[18]利用超声波定位脑血管位置的方法，在超声图像上寻找动脉的最优穿刺点，用活检穿刺针穿刺该部位，并留针5 min制造脑出血模型，可以形成体积大小几乎一致的血肿块。犬类脑出血动物模型的构建由于受试动物体积较大，脑出血部位比较清晰，可以更明确地在MRI上观察到血肿块及出血部位组织结构的变化过程。同时应用犬类制作的脑出血动物模型，可以观察到在贫血性缺氧的情况下，大脑的血流动力学、血液中的氧供应与糖酵解稳态之间的相互作用关系,对于脑出血后患者的脑缺氧的症状研究有很大的帮助,同时犬类动物模型较灵长类动物模型在受试动物的成本上更适宜，且有较好的实验效果，故在部分的实验中还会选用犬类动物做脑出血的动物模型[19]。但犬类动物也存在饲养价格较高，研究周期较长的不利情况，同时实验动物给药、记录数据存在一定困难，所以大规模进行实验研究也不利于实验开展。

1.3猪脑出血动物模型 猪脑出血动物模型主要采用自体血注入法和微囊注入法制作脑出血动物模型，可以获得稳定且体积大小相差很少的血肿块，但由于猪的体积较大，且获得的实验数据可以通过犬类等其他动物模型获取，性价比低，故临床实验研究一般少用此类实验动物[20-22]。

1.4兔脑出血动物模型 兔脑出血动物模型的使用在临床试验中很常见，因与人类有着相似的脑血管形态特征，且成本低，体积小，故也经常被用于脑出血模型制作的选择动物。Kaufman等[23]首次采用了兔作为脑出血模型的受试动物，应用自体血单步注入的方法，进行脑出血的动物建模。也有研究记载采用两步注入法构建兔脑出血动物模型，可以有效地避免血肿破入侧脑室和蛛网膜下腔造成蛛网膜下腔出血的情况发生，同时可以生成稳定均匀的血肿块，对神经功能的损伤较轻且后续恢复较好[24]。

1.5啮齿类脑出血动物模型 啮齿类动物模型的选择一般选用大鼠用来制作脑出血动物模型，因为大鼠比小鼠拥有更大的脑组织，更便于观察实验诱发脑出血后脑组织的组织形态变化和血管内血流信号的变化，且大鼠体积较小，繁衍易得，周期短，成本较低，适合于大样本量的实验室脑出血动物模型的制作，同时大鼠的神经系统发育与人类相似，基因组成与人类高度同源，所以近年成为脑出血模型的主要选择动物。因此本文将采用大鼠实验动物模型概述脑出血动物模型的制作方法，为以后的研究提供参考。

2 实验动物脑出血模型的制备方法

大鼠脑出血动物模型经过科研人员多年的探索，形成了多种不同途径的制作方法，而目前比较常用的大鼠脑出血模型主要包括自体血注入脑出血模型、胶原酶注射脑出血模型、微球囊充盈脑出血模型、自发性(高血压性)脑出血模型等4种脑出血动物模型。

2.1自体血注入脑出血模型 自体血注入法制备脑出血模型是目前应用最广泛的一种脑出血模型制备方法，主要是运用注射动物自身(非肝素化)自体血的方式，形成局部脑出血模型。模型制作方法通常是麻醉固定好动物以后，通过定位技术将自体血注入动物脑内基底核使之造成脑部出血水肿模型。

血液注入法历史沿革可大致分为单步注入法、两步注入法和三次注入法。单步注入法最早由Ropper等[25]提出，但此时所用血为异体血，受试动物采用无麻醉的方法，直接将血液注入受试动物基底核区。此法比较符合临床患者清醒时发病状态，但异体血注射弊端较多，会产生排异等不良反应。经过诸多研究者的实验研究，逐渐将异体血变为实验动物自体血，同时通过改变血流压力、使用不同大小的注射器、改变注射量及注射时间等方法，将单步注射法的实用性进一步加强，但由于实验需控制的变量较多，实验重复率及成功率较低。在此基础上Deinsberger等[26]进一步研究进行两步注射法。先注射20 μL的自体血，后静止针头7 min，使血凝块形成将针道封住，再注射30 μL的自体血。该方法减少了破裂出血血肿延伸至硬膜下间隙的失败次数，但仍有血液反流问题的产生。后有学者研究进行了三步注入法，适用于出血量更大的动物模型的制作，多次的注入可以比两步注入法能更好地控制血液反流现象的发生，更好地保证实验动物受试部位所需要的压力和血流量[27]。自体血注入法的优点在于可以很好地观察自体血注入脑组织后，在脑组织释放的血管活性物质对脑组织的刺激病理作用，符合临床患者脑出血疾病发生的病理生理过程，在临床上具有较强的可借鉴性。但此方法也有一定的局限性，由于是外在注射器注入体内血液造成的脑出血，血液返流现象还是会对血肿的形成及大小有一定的影响，而目前通过使用电子微量注射等注射流量控制辅助仪器有效改善了这种情况。

2.2胶原酶注射脑出血模型 胶原酶注入法是指在脑内局部注射胶原酶，胶原酶可以溶解血管内皮下基膜层和细胞间基质的胶原，造成血管壁破坏，从而造成脑出血的发生。胶原酶是从溶解组织的梭状芽胞杆菌中提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分[28]。胶原酶动物模型基本操作过程是向脑组织中注射胶原酶，10 min后脑组织周围开始出现出血点，并向周围渗血，5～24 h开始出血并形成完整的血肿块。胶原酶的种类有很多种，目前在脑出血动物模型制备中最常用的是Ⅶ型胶原酶模型,其次应用广泛的是Ⅵ型胶原酶蛋白。有研究发现，注射0.5 U的Ⅶ型胶原酶的生理盐水2 μL，注入大鼠尾状核内，10 min后即有血液渗出，这个剂量方法制备出的动物模型受试动物死亡率最低，所以得到了广泛的推广应用[7,29]。胶原酶注入法的优点是通过胶原酶局部注入，形成血块大小和形状可以得到较好控制，并且补足了采用自体血注入时不能模拟人体自身血管破裂造成脑出血的问题，可以较好地模拟临床患者脑出血脑内血肿扩大的发病过程，模型制作简单快捷，可重复性好。该方法克服了由于血液返流造成的血肿体积减小，固定靶点组织的血肿形成较好，可以观察血肿形成过程中的模型机体反应情况。该制备模型也存在一定的不足之处，由于胶原酶注入后是弥散性出血引起的血肿，所以形成的血肿存在的时间比较短，且由于弥漫的时间较慢，不太符合临床上脑出血急性出血期的发病机制，且由于胶原酶自身带炎症反应和有细胞毒性作用，不同于自身患者脑出血形成的血肿，会对血脑屏障产生较强的破坏，且恢复时间较长，所以不适用于脑出血的发病机制的研究，而更加适用于对脑出血后治疗恢复期的各项指标的研究[11,28,30-31]。

目前针对脑出血的研究中，应用比较广泛的是自体血注入法和胶原酶注入法，应用这两种方法可以从多个角度观察脑出血模型，而观察脑出血中血肿块的形态学改变可以更直观地描述脑出血的危害程度[32-34]。自体血注入法和胶原酶注入法比较，自体血注入法制备的脑出血动物模型可以模拟血肿形成的占位效应、血液在血管外对脑组织的损害等，可以看到血肿周围有明显的细胞浸润；而胶原酶注入后所形成的脑血肿较自体血注入法形成的脑出血血肿更加清晰明显，出血后再次形成血肿过程以及血肿后出现水肿和炎症反应,同时会伴随明显的神经功能障碍表现。在急性脑出血时，采用Ⅵ型胶原酶制备脑出血动物模型，可以清楚地观察到大鼠出现了氧化应激反应及神经样改变[35],机体生成大量的氧自由基和丙二醛(Lipid Peroxidation,MDA)，进而对脑组织产生毒性作用[36]，加重神经功能的损伤。采用胶原酶的方法进行脑出血模型制备，胶原酶本身就可以产生细胞毒性作用，运用此方法制备的实验大鼠，在实验后期对大鼠进行药物治疗，能够很清晰地观察到受试动物神经功能的改变，这也是需要科研工作者值得注意的事项。同时，由于脑出血后患者第一天就有可能出现溶血现象，红细胞的溶解会导致脑水肿、神经元坏死和神经功能缺陷,随着时间的推移，神经功能障碍会越来越严重[37-38]。胶原酶注射法可以针对脑出血后神经功能的不同程度的损伤提供研究适用的方法，在临床上可以针对性地进行治疗，以提高患者的生存率。

2.3微球囊充盈法 微球囊充盈法是采用向脑组织内插入微球囊，微球囊扩充使得脑组织受压迫出血，该方法是模拟颅内压升高的状况的一种方法。该方法的优点在于机械压迫出血可人为操纵压迫位置的范围，精准控制血肿大小，具有可重复强，使用方便的优点，故可以利用控制微球囊扩张的时间来研究血肿的各种形态大小，可用于外科手术对于血肿的清除的研究[39]，但由于是机械压迫出血，并没有血管刺激性因子的加入，并不能直观反应细胞毒性作用，不能用来评估血液本身存在的成分，血管和周围组织的理化环境变化，对于脑出血后各种细胞组织的损害状况不好观察，不适用于脑出血发病机制的研究。对于出血后各项指标的研究也不如自体血注入法，故现在临床试验一般很少采用微球囊充盈法。

2.4自发性脑出血模型(高血压型) 高血压性脑出血是一种严重危害人类健康的疾病，是高血压最严重的并发症之一，在不同原因脑出血中其致残率、致死率很高。该病的发病机制最为复杂，目前研究中主要有以下几种发病机制：(1)血压增高为脑血管破坏的病理生理基础；(2)星形胶质细胞的破坏；(3)脑内血肿的扩大；(4)高血压脑出血继发性损害，所产生的凝血酶被认为是引发脑水肿的重要因素之一[40]。高血压脑出血模型现在一般主要有两种，一种是肾源性高血压大鼠，另一种是自发性高血压大鼠[11,41-42]。自发性高血压大鼠通过基因敲除获得，目前已有实验室通过基因培育的方法培育出易出血的高血压基因鼠，可以在出生数日起血压自发升高，并在短时间就可以发生自发性脑出血。该模型的出血部位主要在大脑前内侧皮质、枕皮质和基底节部位，和人类脑出血的部位相似，可以制作出比较理想的脑出血大鼠模型。但这类大鼠模型一般需要的成本较高，且大鼠死亡率也比较高，只能应用于高血压性脑出血实验模型，故目前实验室经常使用肾源性高血压大鼠。肾源性高血压模型优点是制作简单，采用结扎双侧肾动脉，使双侧肾动脉缩窄进而诱导高血压动脉硬化，诱发脑出血的产生。运用此方法诱导的高血压，高压峰值稳定，且能并发与人类高血压病类似的脑动脉损害及各种类型的脑出血[43]。该方法成本较低，但也存在一定的缺陷，受试大鼠的个体差异性的影响使得脑出血的发生率不确定，每次实验存在较大的客观差异，重复性不太好。除此外也有用药物诱导高血压脑出血模型的方法，对受试小鼠定量注入血管紧张素Ⅱ和一氧化氮合酶抑制剂使小鼠产生慢性高血压，再通过后续注射血管紧张素Ⅱ可以诱发高血压性脑出血[44]。药物诱导的方法应用简单方便，但不能形成一致的出血部位，存在个体差异性较大，可复制性差的缺点。高盐诱导法也可诱发高血压的产生，有研究认为氯化钠对脑血管的破坏作用直接导致了脑出血的产生[45]。传统观点认为高盐高钠摄入会使得血管的渗透性增强，血管管壁韧性减少，脆性增加，当血流量增加时很容易造成血管破裂引起脑出血发生。高盐诱发的脑出血，受试动物的出血体积较小，且散在存在于脑部，对脑组织有轻微的破坏，比较符合人类少量多发脑出血的发病机制，但由于出血量不可控，实验可重复性差，出血部位变化不定，故不太适用于一般大规模的脑出血模型的制备。

3 其他脑出血动物模型及影响因素

除了上述比较常用的脑出血动物模型外，根据脑出血的不同部位还有针对性的脑出血模型制备方法。如在研究大脑皮层出血时，撕裂相应脑血管制作脑出血动物模型，采用细针撕裂静脉导管引起大脑皮层出血。该方法简单实用，针对性强。除了方法选择不同，实验过程中的客观因素对于最终的实验结果也有很大影响，其中影响较大的因素之一是动物的年龄[46]。脑出血的发生往往是伴随着年龄的不断增长，发病率不断增加，而受试动物一般处于动物年轻的时期，单纯运用上述方法诱发脑出血的发生，与人类随着年龄的增长机体机能逐渐退化不相符合，尤其是脑功能退化，而脑出血后对患者进行神经功能的评估是治疗脑出血患者的一个重要指标，故实验过程这些因素在一定程度上影响着实验结果与临床应用的差别，在以后的实验中应考虑这些因素的存在。

脑出血的模型制备方法经过历年研究发展，各种模型都具有在临床或基础理论实验方面的可用性，但又各有不足，目前应用最广泛的是自体血注入法和胶原酶注入法这两种方法，微球囊充盈法和自发性脑出血方法虽有制备简单的特点，但微球囊充盈法存在较多的局限性，而自发性脑出血方法需控量较多，且成功率较低，所以综合以上4种方法，目前最常使用的建模方法是自体血注入和胶原酶注入法。任何的实验方法都存在一定的不足之处，要获得更加完备的实验建模方法，需要一个长时间研究的过程，在考虑好受试动物伦理的情况下，找出更加符合临床患者脑出血生理病理改变的动物模型实验方法。