外源6-BA对干旱胁迫下苹果砧木M26的生理效应

2023-01-08李彩龙李毛毛高彦龙张仲兴张德王双成缐旭林王延秀

甘肃农业大学学报 2022年5期

李彩龙，李毛毛，高彦龙，张仲兴，张德，王双成，缐旭林，王延秀

（甘肃农业大学园艺学院，甘肃兰州 730070）

干旱胁迫下，植物通过关闭气孔，降低生理活动来减少水分散失，并通过增加渗透调节物质维持正常生理活动［1］。气孔关闭会阻碍光合气体交换，造成光合作用下降［2-3］。在我国西北干旱和半干旱地区，水分短缺是果树生长的主要限制因子［4］。研究表明，外源添加肌醇［5］、褪黑素［6］、水杨酸、脱落酸和海藻提取物［7］等均可不同程度提高苹果的耐旱性。因此，筛选缓解干旱胁迫适宜浓度的外源物，对西北地区苹果产业的发展具有重大意义。

6-BA属广谱型植物生长调节剂，在促进细胞生长和营养物质运输方面具有重要作用［8］。前人在黄柏［9］、辣椒［10］上的研究表明，6-BA可以提高植物对低温弱光环境的抵抗性。Chen等［11］研究认为，施用6-BA能增加芥菜的生长量和总叶绿素含量。有学者发现，6-BA通过调节脂肪酸代谢的相关过程，进而平衡蛋白质代谢，改善植物生理状态［12］。杨艳华等［13］在水稻上的研究表明，缺镁胁迫会对植物代谢造成一定的破坏，而喷施6-BA可在一定程度上缓解缺镁胁迫对植物造成的伤害，改善缺镁造成的植物营养缺乏症。盐胁迫下，6-BA可通过清除体内多余的自由基，减轻盐害，增强植物的耐盐性［14］。刘凯歌等［15］发现，喷施外源6-BA可有效降低高温胁迫下甜椒幼苗叶片的超氧阴离子产生速率、MDA含量以及相对电导率，进而维持甜椒正常的光合作用和生长。目前已有诸多6-BA在作物抗性上的研究报道，但在苹果砧木上研究报道较少，因此本试验以此为切入点，展开研究。

20世纪60年代，我国从欧洲引进M26，其树势中庸，生根较好，嫁接亲和性良好，较抗寒，具有良好的早实性和丰产性等特点，但其耐旱性差［16］。本试验以树龄2 a的M26自根砧为材料，探讨干旱胁迫下M26对外源6-BA的生理响应，以期为外源6-BA处理下苹果砧木抗旱性研究及栽培生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

本试验选用树龄2 a生长势一致的M26自根砧苗72株，栽入装有3 kg基质，质量0.7 kg的花盆中，每盆1株，培养30 d后，采用称重法控制土壤含水量，进行干旱胁迫处理，保持干旱处理的含水量为田间持水量的（50±2）%。干旱胁迫前花盆浇透水，然后使其自然落干，每天称重补水，使土壤含水量控制在设定的相对含水量，连续控水。试验设6个处理，以土壤含水量为田间持水量的80%为对照（CK）、干旱胁迫（T1）、干旱胁迫+25 mg/L6-BA（T2）、干旱胁迫+50 mg/L6-BA（T3）、干旱胁迫+75 mg/L6-BA（T4）、干旱胁迫+100 mg/L 6-BA（T5），每处理3次重复，每次重复4株（4盆）。其中，6-BA溶液以叶片喷施的方式于每日18∶00喷施，每盆均匀喷施25 mL，每隔5 d喷施1次，共喷施3次，CK喷施等量清水。干旱胁迫处理次日开始计算胁迫时间，于胁迫第0、5、10、15、20天时选取生长一致的中上部相同节位叶片进行各项指标测定。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 生理指标的测定叶绿素含量测定：分别在干旱胁迫第0、5、10、15、20天时采样，用蒸馏水将叶片表面清洗干净，用80%丙酮浸泡24 h后提取，测定665、649 nm下的吸光度，代入公式计算Chl a和Chl b的含量，两者之和为Chl（a+b），两者之比为Chl a/b［17］。

光合参数：采用便携式光合仪（LI-6400，LICOR，Linco ln，NE，USA），于干旱胁迫的第0、5、10、15、20天上午9∶00～11∶00，选取向阳成熟叶片测定净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、胞间CO2（Ci）、气孔导度（Gs），每个处理选取3株。

荧光参数：采用IMAG-ING-PAM叶绿素荧光成像仪测定荧光参数，与光合参数测定同步，经30 min暗处理后测定。并用Imaging Win Geg E software（Walz，Ef-feltrich，Germany）软件（Walz，Ef‐feltrich，德国）分析数据。

其他参数：分别在胁迫第0、5、10、15、20天取植株中上部功能叶片，擦洗干净，去掉叶脉进行相关指标测定。相对电导率（REC）采用电导仪法［18］，游离脯氨酸（Pro）含量采用酸性茚三酮法［19］，超氧化物歧化酶（SOD）采用氮蓝四唑光化还原法［20］，过氧化物酶（POD）采用愈创木酚法［21］，过氧化氢酶（CAT）采用紫外吸收法［21］，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法［22］，可溶性糖（SS）含量采用蒽酮比色法［23］测定。

1.2.2 主成分分析综合得分主成分分析综合得分（F）是每个主成分得分与对应贡献率乘积之和。

1.3 数据处理与分析

试验用Origin 2018和Excel 2016进行数据处理及作图，采用SPSS 22.0单因素ANOVA的LSD法比较差异显著性（α=0.05）。

2 结果与分析

2.1干旱胁迫下外源6-BA对M26叶片叶绿素含量的影响

由图1-A可得，随着胁迫时间的延长，Chl a含量呈不断下降趋势。胁迫第5天时，随外源物浓度升高，Chl a含量呈现先升后降的趋势。胁迫至第20天时，各处理Chl a含量均达到最小值，分别为16.52（T1）、21.07（T2）、26.23（T3）、22.74（T4）、18.37 mg/g（T5），显著低于38.04 mg/g（CK）。其中T3降幅最小，为30.99%；T1降幅最大，为56.02%。

图1-B表明，Chl b与Chl a的趋势相同，胁迫期间呈下降趋势。胁迫至第10天时，Chl b含量出现明显的下降。胁迫至第20天，各处理的Chl b含量均达到最低值，且均显著低于CK。其中，T3的降幅最小，为13.89%。

同Chl a与Chl b变化趋势一致，Chl（a+b）含量随胁迫时间的延长不断下降（图1-C）。胁迫至第10天时，随6-BA浓度的增加，Chl（a+b）含量呈先升后降的趋势。至第20天时，各处理Chl（a+b）含量均达最小值，均显著低于CK，但不同处理的降幅不同。T3的降幅最小，为23.64%。

在干旱胁迫下，随时间延长，M26叶片的Chl a/b呈下降的趋势（图1-D）。胁迫至第20天时，各处理Chl a/b含量均达到最小值，分别为T1（0.95）、T2（1.12）、T3（1.21）、T4（1.11）和T5（1.03），均显著低于CK（1.50）。T3的降幅最小，为19.33%；T1降幅最大，为35.37%。

图1 干旱胁迫下外源6-BA对M26叶片光合色素含量的影响Figure 1 Effects of exogenous 6-BA on photosynthetic pigment content of M26 leaves under drought stress

2.2 干旱胁迫下外源6-BA对M26叶片光和特性的影响

图2-A表明，随处理时间延长，M26叶片的Gs呈逐渐降低的趋势，CK无明显变化。胁迫至第20天时，各处理的Gs均达到最小值，较CK分别降低47.81%、49.33%、46.13%、42.74%、44.61%，T4降幅最小。

由图2-B可知，胁迫时间至第20天，不同处理下的Pn均降到最低，分别为7.55（T1）、7.51（T2）、7.50（T3）、7.31（T4）、7.45（T5），均显著小于CK（9.12）。

与Gs和Pn变化趋势相反，随着处理时间的持续，M26叶片的Ci呈不断上升趋势（图2-C）。胁迫至第10天时，Ci已出现明显的增加。第20天时，各处理的Ci均达最大值，均显著高于CK。其中，T5升幅最大，为26.08%；T3升幅最小，为24.56%。

M26叶片Tr的变化趋势同Pn大致相似，呈逐渐降低趋势（图2-D）。胁迫至第10天时，随6-BA浓度增加，Tr呈先升后降的趋势。第20天时，各处理Tr出现大幅度下降，达到最低值，均显著低于CK。与CK相比，T3降低26.50%，T5降低28.55%。

图2 干旱胁迫下外源6-BA对M26叶片光合特性的影响Figure 2 Effects of exogenous 6-BA on photosynthetic characteristics of M26 leaves under drought stress

2.3 干旱胁迫下外源6-BA对M26叶片荧光参数的影响

由图3-A可知，随着处理时间的延长，F0呈现持续下降的趋势，CK无明显变化。胁迫至第20天时，各处理的F0分别下降到0.17、0.17、0.17、0.16、0.14，均显著小于CK（0.25）。其中，T5的降幅最大，为44.58%。

图3-B显示，随着胁迫时间的延长，Fm值出现逐渐下降的趋势，具有浓度效应，不同浓度处理下降幅不同，CK无明显变化。胁迫至第10天时，Fm出现明显的下降趋势。第20天时，各处理均达最低值，较对照分别下降47.54%、46.97%、51.61%、51.67%、48.15%。

与F0和Fm的变化趋势相同，随着处理时间的延长，Fv/Fm呈现不断下降的趋势（图3-C）。在处理的各时间段，T3处理下Fv/Fm下降最小，表明T3浓度可能为缓解干旱胁迫较适宜的浓度。胁迫至第20天时，各处理下降到最小值，分别为0.40（T1）、0.47（T2）、0.46（T3）、0.42（T4）、0.41（T5），均显著低于CK。

图3 干旱胁迫下外源6-BA对M26叶片荧光特性的影响Figure 3 Effect of exogenous 6-BA on fluorescence characteristics of M26 leaves under drought stress

2.4 干旱胁迫下外源6-BA对M26叶片MDA含量和相对电导率的影响

由图4-A显示，随干旱胁迫时间的延长，MDA含量不断上升。随着外源6-BA浓度不断增加，胁迫第5天时，MDA含量变化幅度较小，在第10、15、20天时出现明显的先降后升。胁迫至第20天时，各处理MDA含量达到最大，分别为6.02（T1）、5.88（T2）、5.55（T3）、5.44（T4）、5.69（T5）μmol/g（T5），与CK相比分别提高41.99%、40.61%、37.15%、35.88%、38.63%。

由图4-B表明，随着胁迫时间的持续，M26叶片的REC呈上升趋势，胁迫至第10天时，REC呈先降后升的趋势，前5 d变化幅度不大，随时间的延长，变化趋势越来越明显，且T4为最低值。胁迫至第20天时，各处理REC达到最大值。其中，T1升幅最大，T4升幅最小，较CK（26.47）分别升高96.11%和27.96%。

图4 干旱胁迫下外源6-BA对M26叶片MDA含量和相对电导率的影响Figure 4 Effects of exogenous 6-BA on MDA and REC in M26 leaves under drought stress

2.5 干旱胁迫下外源6-BA对M26叶片渗透调节物质含量的影响

由图5-A可知，随胁迫时间的延长，Pro含量不断增加，CK无显著变化。在胁迫第5天时，随浓度增加Pro含量先升后降。胁迫至第20天时，各处理上升到最高点。其中，T4处理升幅最大，T1处理升幅最小，相比于CK分别升高37.86%和24.51%。

由图5-B可得，在干旱胁迫至第15天时，各处理的SS含量达到最大值，分别为9.78（T1）、11.85（T2）、14.33（T3）、16.69（T4）、13.01 μmol/g（T5）。与CK相比，T1增幅最小，为38.22%；T4增幅最大，为63.80%。

图5 干旱胁迫下外源6-BA对M26叶片Pro、SS含量的影响Figure 5 Effects of exogenous 6-BA on Pro and SS in M26 leaves under drought stress

2.6 干旱胁迫下外源6-BA对M26叶片抗氧化酶活性的影响

由图6-A可知，随着胁迫的持续，各处理的SOD活性呈现先升后降的趋势。胁迫至第5天时，SOD活性达到最大值。胁迫至第20天时下降到最小值，其中降幅最大和最小的为T1和T3处理，分别较CK降低31.09%和16.43%。

由图6-B可以看出，随胁迫时间的延长，CAT活性呈不断下降趋势。胁迫至第5天时，不同浓度处理下，CAT活性呈先升后降的趋势。除第15天和第20天时T2和T5为最小值，其余胁迫时间段最小值均为T1。胁迫至第20天时CAT活性最小，其中T4活性最大，为170.15 U/g；T5活性最小，为146.31 U/g，且均显著小于CK。

同SOD的变化趋势相似，随着处理时间的持续，POD活性呈现先升后降的趋势（图6-C）。胁迫至第5天时，各处理达最大值。胁迫至第20天时，各处理的POD下降到最低，分别为129.65（T1）、136.26（T2）、161.65（T3）、148.26（T4）、143.51 U/g（T5），显著小于CK（205.96 U/g），相比于CK分别下降37.05%、33.84%、21.52%、28.02%、30.32%。

图6 干旱胁迫下外源6-BA对M26叶片SOD、POD、CAT活性的影响Figure 6 Effects of exogenous 6-BA on SOD，POD and CAT in M26 leaves under drought stress

2.7 干旱胁迫下外源6-BA对M26叶片生理效应的综合评价

2.7.1 相关性分析对干旱胁迫后M26的18个指标进行相关性分析，见表1。结果表明，M26叶片的Pn与Gs、F0、Fm、Fv/Fm呈极显著正相关（P<0.01）；与Chl a、Chl（a+b）、Chl a/b、SOD呈显著性正相关（P<0.05）；与Ci、Pro呈极显著负相关（P<0.01）；与MDA呈显著负相关（P<0.05）。

2.7.2 主成分分析对所有处理中的18个指标进行主成分分析，提取特征值大于1的3个主成分，其特征值分别为14.38、1.87、1.49，累计方差贡献率为98.55%，符合分析要求。表2显示，第一主成分（PC1）综合Gs、Tr、Fm、Fv/Fm等指标；第二主成分（PC2）综合Ci、Chl a、Chl b、Chl（a+b）、Chl a/b、Pro、SS、POD、SOD等指标；第三主成分（PC3）综合Pn、MDA、REC、CAT、F0等指标。由表3知，各处理的综合得分分别为1.555（CK）、-0.563（T1）、-0.234（T2）、0.073（T3）、-0.152（T4）、-0.679（T5）。M26在不同浓度6-BA处理下的综合得分排名为CK>T3>T4>T2>T1>T5。

表2 主成分分析方差解释Tab2 Total variance explained

表3 M26在不同处理下的综合得分及排名Table 3 comprehensive scores and ranking of M26 under different treatments

3 讨论

叶绿素是叶片吸收和转化光能的主要光合色素，若植物长时间处于胁迫条件下，叶绿素与叶绿体蛋白结合就会变得松弛，从而叶绿素被分解，光合速率下降［24］。胡雪琴等［25］在水稻上的研究中发现，在干旱胁迫下，适宜浓度的6-BA可使水稻叶内形成气腔，促使叶增厚，减少叶肉细胞内叶绿体及叶绿素的降解。本研究表明，随着干旱胁迫的持续，各处理叶绿素含量均有所下降。其原因可能是干旱胁迫破坏了叶绿体结构，影响了叶绿素合成。通过喷施不同浓度的6-BA，叶绿素含量下降速率有所减缓，表明6-BA可以缓解这种伤害，缓解的效果与6-BA施用浓度有关。

光合系统的正常运转对植物生长发育具有重要意义［26］。研究表明，胁迫对植物光合作用的影响分为气孔限制和非气孔限制［27］，其不同之处在于Gs与Ci的变化趋势是否相同，若一致则是气孔因素造成，反之则是由非气孔因素引起［28］。本试验中，当Gs下降的同时Ci升高，表明光合作用受非气孔因素影响，可能是胁迫导致光和电子传递受阻，影响卡尔文循环相关酶的活性，减慢CO2同化效率，使Gs下降、Ci升高［29］。叶绿素荧光技术可作为测定植物光合作用的无损探针［30］。一般认为，F0降低表明PSII天线色素的热耗散增加，而F0升高表明PSII反应中心受到伤害［31］。Fm是PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量，可反映经过PSⅡ的电子传递情况。Fv/Fm的变化反映胁迫下PSII的损伤程度，Fv/Fm下降越多，表示PSII损伤越大［32］。持续干旱，F0不断下降，这可能是M26叶片为减轻光抑制，避免伤及PSII反应中心所致。Fm逐渐下降，可能是干旱胁迫使光合电子传递受阻。Fv/Fm也持续下降，说明PSII反应中心可能受到更严重的伤害［33］。喷施不同浓度外源6-BA后，M26叶片的F0、Fm、Fv/Fm都在不同程度上有所提高，说明外源6-BA可能增强了干旱胁迫下PSII电子传递活性和通过热耗散实现光保护机制。然而，光合系统运转是一个复杂的过程，6-BA具体作用机制还需进一步研究。

细胞膜对于维持细胞代谢具有重要意义。干旱胁迫可以改变细胞膜的通透性，细胞内电解质外渗，相对电导率升高。相对电导率是反映植物细胞膜稳定性的一项重要生理指标［34］。本试验中，随着干旱胁迫的持续，REC呈升高的趋势，是由于干旱胁迫使膜的通透性增大，电解质外渗［35］。喷施6-BA后，减缓了REC的上升速率，且随着6-BA浓度的增大，REC呈先降后升的趋势，说明外源6-BA对干旱胁迫引起的膜透性变化具有保护作用，且浓度过低或过高，保护作用减弱。在逆境条件下，常常发生膜脂过氧化作用，MDA是其产物之一，能反映膜系统受损程度［36］。本研究中，随着干旱胁迫的持续，MDA呈升高趋势，这表明膜系统受损，质膜发生过氧化。喷施6-BA后，MDA上升速率减慢，可能是6-BA增强了保护酶活性和生物膜稳定性，缓解了干旱对M26植株的伤害。

植物长时间生存在逆境环境下，渗透平衡会受到严重破坏，此时植物自身会合成渗透调节物质，保证植物正常生长。本试验中，随胁迫时间延长，M26植株体内Pro大量积累，说明M26可以通过积累渗透调节物质来抵抗干旱胁迫，喷施外源6-BA后Pro含量进一步升高，从而缓解干旱对M26造成的伤害，这与张晓燕等［37］的研究结果相似。SS可作为渗透调节因子，调节细胞渗透势，提高组织保水能力，进而维持细胞形态［38］。本研究发现，在干旱胁迫至第20天时，SS含量相比CK有所升高。相比干旱处理，喷施6-BA后SS含量上升更高，说明外喷6-BA能促进胁迫处理后M26幼苗渗透调节物质的合成积累。

干旱胁迫下植物会产生大量活性氧，对植物产生毒害，影响其正常生长，而SOD、POD、CAT作为植物体内重要抗氧化防御系统，可清除植物体内的活性氧，使膜脂过氧化程度及膜受损程度降低［39］。本试验中，随着干旱胁迫时间的延长，SOD和POD活性呈先升后降的趋势，而CAT活性则是不断降低，这可能是干旱胁迫导致过氧化程度加剧，质膜受损。喷施外源6-BA后，SOD、POD、CAT的活性显著高于未喷施的处理，表明喷施外源6-BA可以提高SOD、POD和CAT的活性，保持活性氧清除系统的动态平衡，维持植物在干旱条件下的生长。这与前人在油茶［40］、水稻［41］、紫花苜蓿［42］研究中得到的结论相似。

植物的抗旱性受多种因素影响，单个指标不能准确反映植物抗旱的主要机制，因此，本试验中选用M26的18个指标进行耐旱性的综合评价。相关性分析表明，M26叶片的Pn与Gs、F0、Fm、Fv/Fm呈极显著正相关（P<0.01），与Chl a、Chl（a+b）、Chl a/b、SOD呈显著正相关（P<0.05），这说明Gs、F0、Fm、Fv/Fm的降低是M26适应干旱胁迫的重要机制，且Chl a、Chl（a+b）、Chl a/b、SOD含量的降低也是影响Pn降低的原因。Pn与Ci、Pro呈极显著负相关（P<0.01），与MDA呈显著负相关（P<0.05），这说明当Pn下降时，M26还通过积累Ci、Pro、MDA等物质来调节干旱胁迫对M26植株的伤害［43］。因此，可用Gs、F0、Fm、Fv/Fm、Ci、Pro、Chl a、Chl（a+b）、Chl a/b、SOD、MDA等指标来评价M26的耐旱性。主成分分析显示，第一、第二、第三主成分方差贡献率分别为79.866%、10.386%、8.299%。累计方差贡献率达到98.554%，根据方差累计贡献率>85%的原则，符合分析要求。综合得分排名为CK>T3>T4>T2>T1>T5。第一主成分（PC1）综合Gs、Tr、Fm、Fv/Fm等指标，第二主成分（PC2）综合Ci、Chl a、Chl b、Chl（a+b）、Chl a/b、Pro、SS、POD、SOD等指标。第一主成分中，Gs、Tr是调节光合作用的重要指标，Fm、Fv/Fm是损伤的重要指标，这说明在干旱胁迫下，M26主要通过调节光合作用来适应干旱胁迫。第二主成分中，Chl a、Chl b、Chl（a+b）、Chl a/b是损伤的重要指标，Pro、SS是主要的渗透调节指标，POD、SOD是抗氧化酶，这说明在干旱胁迫下，M26还通过积累Pro、SS等渗透物质，提高POD、SOD等抗氧化酶活性来缓解伤害［44］。此外，通过综合分析可得出，喷施外源6-BA后，可以缓解干旱对M26植株造成的损伤，且50 mg/L 6-BA为较为适宜的浓度。