MK571通过激活法尼醇X受体抑制肝脏胆汁酸合成

张明康，周燕，陈宇玥，勾雪艳，武新安，3

（1.兰州大学药学院，甘肃兰州 730020；2.兰州大学第一医院药剂科，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省临床用药风险防控工程研究中心，甘肃 兰州 730000）

胆汁酸主要由肝细胞合成并储存在胆囊中，是体内胆固醇代谢的重要途径［1-2］。胆汁酸合成途径主要有两条，经典途径和替代途径。经典途径主要由胆固醇-7α-羟化酶（cholesterol-7α-hydroxylase，CYP7A1）和胆固醇-12α-羟化酶（cholesterol-12αhydroxylase，CYP8B1）介导，产生至少70%的胆汁酸［3］。替代途径主要由胆固醇-27α-羟化酶（choles‐terol-27α-hydroxylase，CYP27A1）介导［4-5］。胆汁酸的排泄主要通过胆盐输出泵（bile salt export pump，BSEP）和多药耐药相关蛋白2（multidrug resistanceassociated protein 2，MRP2）排出［6］。此外胆汁酸还通过Na+依赖性牛磺胆酸协同转运蛋白（Na+tauro‐cholate cotransporting polypeptide，NTCP）和有机阴离子转运多肽2（organic anion transportingpolypep‐tide 2，OATP2）被肝细胞重吸收。法尼醇X受体（farnesoid X receptor，FXR）是肝脏和肠道中的胆汁酸的传感器。细胞内胆汁酸浓度升高会激活FXR的转录，减少CYP7A1的表达，抑制胆汁酸合成。此外通过抑制NTCP的表达负调节肝细胞对胆汁酸的摄取，促进BSEP的表达，增加胆汁酸的排泄［7］。胆汁酸代谢紊乱与肝胆代谢疾病密切相关［8］。胆汁酸的积累会形成不溶性盐，并在胆管中沉淀，最终导致胆汁淤积，肝细胞损伤甚至肝硬化坏死［9-10］。因此胆汁酸的蓄积已成为诱发胆汁淤积，肝细胞和胆管细胞损伤的重要因素［11］。

MK571是 一 种 白 三 烯D4（leukotriene D4，LTD4）和半胱氨酰白三烯受体1（cysteinyl leukotri‐ene receptor 1，CYSLTR1）抑制剂。据报道MK571可以通过调节细胞因子、粘附分子和阻止内皮氧化型谷胱甘肽的输出，缓解氧化应激，减轻炎症［12-13］。MK571已成功应用于气道过敏、肺部炎症和肾损伤等疾病［14］。此外MK571也是一种常用的多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated proteins，MRPs）抑制剂。抑制MRP5可以显著减轻大鼠败血症引起的急性肺损伤［13，15］。同时MRP2作为肝脏胆汁酸另一条排泄途径，受到MK571的抑制。然而目前关于MK571对胆汁酸合成影响的研究很少，机制更是不明。鉴于胆汁酸在肝损伤中的作用不可忽视，因此本研究主要探讨MK571对肝脏胆汁酸合成及其调节蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，6～8周龄，体质量180～200 g，购自兰州兽医研究所实验动物中心，实验动物证号为SCXK（甘）2020-0002，饲养于兰州大学药学院动物房，室温25℃，昼夜12 h交替，试验期间动物可以自由进食、饮水。所有试验程序和动物护理均在尽量减少动物痛苦的条件下进行，并严格遵循兰州大学动物伦理委员会的指导。

1.2 试验材料

MK571钠盐（纯度>98%）（美国Med Chem Express公 司）；CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、BSEP和NTCP抗体（美国Abcom公司）；FXR和CYP7A1抗体（美国Santa Cruz公司）；RIPA裂解缓冲液（美国Thermo公司）；其余试剂为国产分析纯。

OLYMPUS AU400全自动生化分析仪（日本OLYMPUS光学株式会社）；17/17R低温高速离心机（美国Thermo公司）；Smart WLI光学显微镜（德国GBS公司）；LT-224S分析天平（北京赛多利斯公司）。

1.3 动物分组及试验

供试SD大鼠适应性喂养1周后，根据体质量随机分为4组：MK571低、中、高剂量组和对照组，每组6只，分别每天腹腔注射5、10、20 mg/kg MK571和等体积生理盐水，连续给药7 d，每2 d记录一次大鼠的体质量。

1.4 大鼠肝功能指标含量检测

所有大鼠最后一次处理后，禁食过夜，次日用适量的乙醚麻醉。从腹主动脉获取3 mL血液样品，立即以8 000 r/min离心10 min获得血清，采用全自动生化分析仪检测血清天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、总胆红素（TBIL）和总胆汁酸（TBA）含量。剩余血清储存在-80℃冰箱中用于后续分析。

1.5 苏木精-伊红（HE）染色观察大鼠肝组织病理学变化

收集完血液样品后，立即采集肝组织。一部分放入液氮中快速冷冻，随后转移到-80℃冰箱。另一部分置于4%中性甲醛固定液中固定24 h，用于后续病理分析。HE染色：常规制备肝石蜡切片，梯度乙醇脱蜡，苏木精伊红染色，脱水，中性树胶封片，再加盖玻片，在光学显微镜下观察染色情况。

1.6 UPLC-MS/MS测定大鼠血清和肝脏胆汁酸含量

取出低温储存的血清和肝脏样品，使用UPLCMS/MS方法检测胆汁酸含量。流动相由乙酸铵-氨水溶液（A）（7.5 mmol/L乙酸铵，0.1%氨水，pH 7.5）和甲醇（B）组成。色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）。梯度洗脱比例：0～1 min，45% B→50% B；1～2 min，50% B→65% B；2～4 min，65% B；4～7 min，65% B→90%B；7～7.01 min，90% B→45% B；7.01～14 min，45%B。具体检测条件见表1，注射体积为10µL，流速为0.2 mL/min，柱温保持在30℃。

表1 胆汁酸的UPLC-MS/MS分析方法Table 1 UPLC-MS/MS analysis methods of bile acids

1.7 蛋白免疫印迹法分析

使用适量RIPA裂解缓冲液（RIPA∶PMSF=99∶1，V/V）裂解肝组织，BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度以便调整上样量。再通过SDS-PAGE电泳分离得到不同分子量的蛋白质，并转移到PVDF膜上，然后用脱脂牛奶在室温下封闭1 h。之后PVDF膜 分 别 与 抗NTCP（Abcom，ab131084，1∶1 000）、抗CYP7A1（Santa Cruz，sc-25536，1∶1 000）、抗CYP27A1（Abcom，ab126785，1∶1 000）、抗CYP7A1（Abcom，ab191910，1∶1 000）、抗FXR（Santa Cruz，sc-25309，1∶500）、抗-β-actin（1∶3 000）抗体4℃摇床过夜。然后将膜在HRP偶联的二抗（1∶4 000）中孵育1 h，并使用增强化学发光液进行检测。最后用Image J软件进行灰度值统计。

1.8 统计分析

利用SPSS 17.0软件进行数据统计分析，多组间比较采用单因素方差分析。试验中所有结果用表示，P<0.05表示差异显著。采用GraphPad Prism 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 MK571对大鼠肝功能生化指标的影响

当肝脏受到损伤时，肝细胞膜通透性发生改变，血中AST和ALT水平升高［16］。由表2可知，与对照组相比，MK571干预后血清AST含量呈上升趋势但无显著性差异。高剂量组血清ALT水平显著性降低（P<0.05）。中、高剂量组AST/ALT比值显著性上升（P<0.05）。这些结果表明当给予高剂量的MK571时会造成轻微的肝损伤。同时中、高剂量组TBIL和TBA含量均显著降低（P<0.05）。因此认为，MK571可引起轻微肝损伤，并降低血清TBA和TBIL含量.

表2 各组大鼠肝脏生化指标变化（n=6）Table 2 Changes of liver biochemical indexes of rats in each group（n=6）

2.2 MK571对肝脏组织病理学变化的影响

HE染色结果见图1。对照组肝细胞形态规则，排列规则，并且肝脏未出现炎症细胞浸润、胆管扩张等病理损伤。但高剂量组肝脏汇管区出现炎症细胞浸润（红色箭头），部分肝细胞出现嗜酸性病变。HE结果显示短期低剂量MK571不会引起肝细胞损伤，但高剂量MK571会引起肝脏轻度炎症。

图1 光学显微镜下肝组织HE染色结果观察（×200）Figure 1 Observation of liver tissue HE staining result under an optical microscope（×200）

2.3 MK571对血清和肝脏胆汁酸含量的影响

胆汁酸存在于肝、胃、肾、脑和心脏等不同的器官中，拥有相同的初级胆汁酸（CA和CDCA）［17-18］。在啮齿动物中，CDCA可被羟基化为α-鼠胆酸（α-MCA），并进一步转化为β-鼠胆酸（β-MCA）。并且在大鼠血浆中，β-MCA和CA含量约占总胆汁酸的1/3。在人血浆中，GCDCA和GCA含量约占总胆汁酸的1/2［5］。

大鼠血清胆汁酸的含量检测结果见图2-A。与对照组相比，低、中、高剂量组大鼠血清GCA、CDCA含量显著降低（P<0.05）；中、高剂量组血清LCA、GUDCA、GCDCA、CA含量显著降低（P<0.05）；高剂量组血清TCA和GDCA含量显著降低（P<0.05）；然而，中、高剂量组UDCA含量显著升高（P<0.01）。结果表明MK571干预后，大鼠血清中初级胆汁酸（CA和CDCA）含量显著减少；甘氨酸结合的胆汁酸（GCA，GUDCA，GCDCA，GDCA）和牛磺酸结合的胆汁酸（TCA）显著减少；UDCA含量显著升高（P<0.05）.

大鼠肝脏胆汁酸的含量检测结果见图2-B。与对照组相比，低、中、高剂量组肝脏GCA、GCDCA、TUDCA（中剂量除外）含量均显著降低（P<0.05）；中、高剂量组肝脏中GUDCA、UDCA、β-MCA的含量显著降低（P<0.05）；高剂量组肝脏中CDCA和GDCA的含量显著降低（P<0.05）；然而高剂量组DCA和LCA含量显著升高（P<0.05）。结果表明MK571干预后，大鼠肝脏中初级胆汁酸（β-MCA和CDCA）含量显著降低（P<0.05）；甘氨酸结合的胆汁酸（GCA、GUDCA、GCDCA、GDCA）和牛磺酸结合的胆汁酸（TUDCA）含量均显著减少（P<0.05）。结合血清和肝脏中的胆汁酸含量变化，发现MK571干预后，血清和肝脏中初级胆汁酸和牛磺酸/甘氨酸结合胆汁酸含量均出现显著性降低。此外发现MK571可以增加血清中UDCA含量和肝脏中DCA和LCA含量。

图2 大鼠血清和肝脏胆汁酸的含量Figure 2 The content of bile acids in the serum and liver of rat

2.4 MK571对大鼠血清和肝脏胆汁酸组成的影响

试验发现在正常大鼠体内，游离型胆汁酸在血清中占大多数（图3-A），而牛磺酸结合的胆汁酸在肝脏中占大多数（图3-B）。此外随着MK571的干预，血清游离型胆汁酸比例增加，牛磺酸结合型胆汁酸的比例下降；在肝脏中，甘氨酸结合型胆汁酸的比例下降，牛磺酸结合型的胆汁酸比例增加。这些结果表明大鼠血清主要含有游离型胆汁酸，肝脏主要含有结合型胆汁酸，尤其是牛磺酸结合型胆汁酸。MK571干预后，大鼠血清和肝脏中游离型和结合型胆汁酸的比例发生变化。据此认为MK571可影响大鼠血清和肝脏胆汁酸组成。

图3 血清和肝脏中游离型和牛磺酸/甘氨酸结合型胆汁酸的比例Figure 3 The proportion of unconjugated and taurine/glycine conjugated bile acids in the serum and liver

2.5 MK571对肝脏胆汁酸相关调节蛋白的影响

胆汁酸的合成和排泄受许多代谢酶和转运蛋白的调控。当给予MK571后，大鼠血清中总胆汁酸含量显著降低，血清和肝脏中初级胆汁酸和甘氨酸/牛磺酸结合型胆汁酸含量显著降低。蛋白免疫印迹法结果显示（图4）与对照组相比，中、高剂量组FXR、BSEP和NTCP的表达量均显著增加（P<0.05）；低、中剂量组CYP7A1、CYP27A1、CYP8B1的表达量均显著降低（P<0.05）。以上结果表明MK571可激活FXR，下调CYP7A1、CYP8B1和CYP27A1的表达，减少肝脏中胆汁酸的合成；上调BSEP的表达，促进胆汁酸的排泄。同时发现MK571对上述胆汁酸相关代谢酶和转运蛋白的影响不呈现剂量依赖性。

3 讨论

与空白组比较，**表示P<0.01；*表示P<0.05。Compared with the control group，**represent P<0.01；*rep‐resent P<0.05.

胆汁酸存在于不同的器官中，并且以不同的形式（共轭/非共轭）和不同的比例存在［17］。据报道，通过检测胆汁酸含量变化来检测肝病要比一些传统的方法更灵敏、更准确［8］，其中用血清胆汁酸水平变化诊断肝病更灵敏可靠［19］。人体内每天有将近500 mg的胆固醇转化为胆汁酸［20］。胆汁酸的主要合成部位是肝脏，同时受许多代谢酶的调控，CYP7A1主要催化CA和CDCA的合成，CYP8B1催化CA的合成，CYP27A1和CYP7B1催化CDCA的合成［4，21］。此外许多转运蛋白负责胆汁酸的排泄和重吸收。BSEP是胆汁酸主要的外排转运蛋白，几乎只在肝脏中表达，介导95%的胆汁酸排泄到胆汁中［22-23］。NTCP和OATP2主要负责胆汁酸的重吸收［6］。FXR在维持胆汁酸稳态方面起着至关重要的作用。当FXR被激活时，FXR通过诱导其下游靶基因小分子异二聚体伴侣受体（SHP）或成纤维细胞生长因子15/19（FGF15/19）的活性来抑制胆汁酸的合成［24］。已有研究报道大黄素通过增加FXR和BSEP的mRNA水平和蛋白质表达对小鼠胆汁淤积具有保护作用［25］。同时胆汁酸不仅是FXR的天然配体，还对FXR具有调节作用［10，26］。例如CDCA毒性较小，是一种有效的FXR配体；T-β-MCA和T-α-MCA是FXR拮抗剂［18］。据报道胆汁酸对FXR的亲和力为：CDCA>LCA>DCA>CA，激活力为：CDCA>DCA>LCA［24］。本研究发现大鼠腹腔注射不同剂量的MK571后，血清总胆汁酸含量显著下降；大鼠肝脏中FXR和BSEP的表达显著升高，CYP27A1、CYP7A1和CYP8B1的表达量均有不同程度的降低；血清和肝脏初级胆汁酸和结合型胆汁酸含量显著降低。此外发现肝脏LCA和DCA的含量显著升高，以上结果提示LCA和DCA含量的增加激活了FXR通路，下调肝脏CYP27A1、CYP7A1和CYP8B1的表达，上调BSEP的表达，可显著降低大鼠血清和肝脏胆汁酸的含量。在生理条件下人体中大多数胆汁酸与甘氨酸结合，而在大鼠中，胆汁酸与牛磺酸结合物占大多数［27-28］。此外甘氨酸结合的胆汁酸与肝损伤呈正相关［29］，牛磺酸结合的胆汁酸对血管舒张和内皮功能障碍具有有益作用，并且已成为门静脉高压症的潜在治疗方法［30］。本试验发现随着MK571的干预，血清和肝脏总胆汁酸的组成结构会发生变化。血清中游离型胆汁酸比例增加，牛磺酸结合型胆汁酸的比例下降；肝脏中甘氨酸结合型胆汁酸的比例下降，牛磺酸结合型的胆汁酸比例增加。上述结果提示MK571在肝脏疾病方面具有潜在治疗作用，但仍需要进一步深入探究。

4 结论

MK571通过激活FXR，下调肝脏CYP27A1、CYP7A1和CYP8B1的表达，上调BSEP的表达，显著降低大鼠肝脏胆汁酸的合成。