氧化响应性阿霉素前药胶束在声动力-化学疗法联合治疗癌症中的应用

2023-01-08廖星男李嘉咪邓凯龙清云黄世文徐海波

甘肃农业大学学报 2022年5期

廖星男，李嘉咪，邓凯，龙清云，黄世文，徐海波

（1.武汉大学中南医院医学影像科，湖北武汉 430071；2.武汉大学化学与分子科学学院生物医学高分子材料教育部重点实验室，湖北武汉 430072）

声动力治疗（SDT）作为一种新型的癌症治疗方法，具有非电离辐射、深的组织穿透能力、时空可控性等特点［1］，已成为癌症治疗的研究热点。典型的声动力治疗系统主要由无毒的超声（US）和声敏剂组成。当声敏剂在低强度的超声激发时，可以产生大量的活性氧物质（ROS），如单线态氧（1O2）、羟基自由基（·OH），诱导癌细胞凋亡或坏死［2-5］。尽管声动力治疗在临床前研究发现可以显著抑制各种癌细胞的增殖，但是体内抗肿瘤效果依然无法满足临床需求。

研究发现，提高声敏剂在肿瘤部位的富集率是增强声动力治疗的有效方法。血卟啉作为第1个被报道具有声动力毒性作用的小分子［6］，超声作用下可以在体内将肿瘤的生长率抑制到21%。通过对血卟啉介导声动力治疗癌症机制的广泛和深入研究发现，大量的荧光分子，如卟啉衍生物［7］、叶绿素及其衍生［7-10］、姜黄素及其衍生［11-12］等具有强声敏作用。然而，已报道的有机小分子声敏剂具有疏水性强、化学/生物稳定性差等特点，难以在体内保持长时间的循环，无法在肿瘤有效富集，严重削弱体内声动力治疗效果［13］。随着纳米技术的发展，许多新型纳米平台被开发用于增强体内癌症声动力治疗效果［14-15］。

纳米技术的发展不仅提升了声动力的体内抗肿瘤效果，也为声动力联合化学疗法提供了方法。声动力治疗过程中，癌细胞内产生的ROS辐射范围小（<20 nm）、持续时间短，难以对癌细胞造成致命性损伤，容易导致癌症复发和转移［16］。而声动力联合化学疗法有望提升癌症治疗效果。目前临床化学疗法应用的抗肿瘤药物，如铂类、阿霉素类、紫杉醇类等，存在许多副作用，如心脏毒性、肾毒性、骨髓抑制等［17］。纳米技术的发展显著改善了化疗药物的毒副作用［18］。其中，外部刺激响应性释放化疗药物的纳米平台已广泛用于在临床前癌症治疗研究。通过外源性的光［19］、US［20］、X线［21］等方式，在肿瘤部位实现特异性、时空可控地释放化疗药物，对于联合声动力治疗癌症具有重要意义。

研究发现，DOX不仅是化疗药物，也可以作为声敏剂［22-24］。因此，本研究提出利用1O2特异性响应的酮缩硫醇（TK）键［25］将疏水性DOX和分子量为2 000的亲水性聚乙二醇（mPEG2000）链接，形成具有氧化响应性的DOX前药胶束PTDOX-M，在体外和体内研究PTDOX-M介导声动力-化学疗法的抗肿瘤效果，为癌症治疗提供安全有效的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

二甲基氨基吡啶（DMAP，99%），巯基丙酸（MAA，99%），无水丙酮（99%），二氮二环己基碳二亚胺（DCC，99%）购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。重均分子量2 000的聚乙二醇单甲醚（mPEG2000），盐酸阿霉素（DOX•HCl）购于美国生命科学与高科技集团公司（Sigma-Aldrich）。将mPEG2000与甲苯共沸出水后用无水乙醚沉降以备后用。分析级试剂如浓盐酸、乙醇、环己烷购自国药集团化学试剂有限公司。生物试剂如青霉素链霉素（Hycolon®）、胎牛血清（Gibco®）、高糖培养基（Hyco‐lon®）以及活性氧检测试剂盒（碧云天）均通过国内采购商购买。

1.2 试验方法

1.2.1 PTDOX-M纳米胶束的制备1）将3-巯基丙酸（5.2 g，49.1 mmol）加入无水丙酮（5.8 g，98.2 mmol）中，在干燥氯化氢气体中反应，室温下搅拌4 h。反应后，将产物结晶放入-20℃冷冻。冷冻后的粗产品用正己烷和超纯水按顺序洗涤，经冻干得到含TK键的二羧酸白色粉末（COOH-TKCOOH）。2）在氮气下，将COOH-TK-COOH（252.1 mg，1 mmol）及二环己基碳二亚胺（61.8 mg，0.3 mmol），4-二甲氨基吡啶（61.1 mg，0.5 mol）分散于的10 mL无水二氯甲烷（DCM）中，得到反应体系A。将无水mPEG2000（1g，0.5 mmol）分散于10 mL无水DCM中，得到反应体系B。将反应体积B逐滴加入反应体系A中，在冰浴中搅拌3 h后，在室温下反应24 h。反应后过滤除去沉淀，用乙醚沉降后抽滤，得到白色固体（mPEG2000-TK-COOH）。3）将盐酸阿霉素（60 mg，0.1 mmol）分散于5 mL无水二甲基甲酰胺（DMF）中，加入15 μL无水三乙胺，避光搅拌12 h，得到反应体系C。将二环己基碳二亚胺（20.6 mg，0.1 mmol），4-二甲氨基吡啶（3.7 mg，0.03 mmol）和PEG2000-TK-COOH（130.7 mg，0.06 mmol）分散于10 mL无水DMF中，在氮气下搅拌4～6 h，反应后过滤除去白色沉淀，得到反应体系D。将反应体系C加入反应体系D中，搅拌24 h后，用乙醚沉降，抽滤得到红色固体（mPEG2000-TKDOX）。4）分别称取20 mg mPEG2000-TK-DOX分散于5 mL的无水DMF中，将溶液放入截留分子量为3 500 DU的透析袋中，在去离子水中透析48 h，每隔4 h换一次水，得到纳米胶束PTDOX-M。非氧化响应的胶束PCDOX-M的制备过程中，只需将COOH-TK-COOH转变为丁二酸酐，其他步骤通PTDOX-M的制备过程一致。

1.2.2 纳米胶束在超声条件下ROS产生效果使用DCFH-DA荧光探针检测超声辐射后ROS的产生。配置PCDOX-M、PTDOX-M及DOX（DOX的浓度为1 μg/mL）的水溶液2 880 μL。在各溶液中加入120 μL的预处理后DCFH，置于超声辐射不同时间（1 Hz，2 W/cm2，100%占空比），放置2 h后，使用荧光分度计测量超声不同时间特定波长的荧光强度（λex=488nm，λem=525nm）。

1.2.3 纳米胶束超声条件下DOX的释放将2 mL的PTDOX-M溶液加入截留分子量为3 500 U透析袋中，将透析袋两端扎紧。对透析袋中的PTDOX-M在超声（1 MHz，2 W/cm2，100%占空比）下辐射不同时间。将透析袋放入装有10 mL PBS（pH=7.4）中的离心管中，在37℃恒温水浴中缓慢振荡。在预设时间点，取出3 mL PBS溶液，并加入3 mL新鲜PBS溶液。用荧光光谱仪检测取出的3 mL PBS溶液中DOX含量（λex=488nm，λem=590nm）。

1.2.4 纳米胶束体外毒性研究将4T1细胞以5×103个/孔的细胞密度接种于96孔板内，置于37℃，5%CO2的培养箱内培养12 h。将不同浓度的DOX，PTDOX-M及PCDOX-M与4T1细胞共培养24 h后，用PBS洗去未吸收的材料，加入新的培养基后，在超声或不超声（3 min，1 MHz，2 W/cm2，50%占空比）处理后，细胞在培养箱内继续培养24h。加入噻唑兰MTT后共培养4 h，吸尽MTT后，再加入150 μL的二甲亚砜DMSO，充分振荡10 min后，用酶标仪测量各孔在570 nm处的吸光值。

1.2.5 小鼠体内抗肿瘤效果研究小鼠乳腺癌肿瘤模型构建后，待肿瘤体积约80～100 mm3时。将小鼠随机分为7组进行治疗：1）PBS组；2）Free DOX组；3）PCDOX-M组；4）PTDOX-M组；5）Free DOX+US组；6）PCDOX-M+US组；7）PTDOXM+US组。尾静脉注射药物（DOX：6.5 mg/kg），注射后4 h进行超声处理（1 Hz，2 W/cm2，50%占空比）5 min。每隔3 d进行给药及超声处理，共3次。治疗期间每隔2 d用游标卡尺对肿瘤体积进行测量［26］。治疗结束后对各组的小鼠的肿瘤相对体积及相对体重进行评价。

1.3 数据处理

用Excel表格记录数据，采用SPSS 17.0软件分析处理数据，以P<0.05作为差异有统计学意义，以P<0.01作为差异有显著统计学意义。

2 结果与分析

2.1 氧化响应纳米药物的制备与表征

mPEG2000-TK-DOX的合成过程及1H NMR表征如图1和图2所示。此外，本课题组合成不具备ROS响应的载药纳米胶束PCDOX-M，该纳米胶束利用C-C键将亲水mPEG2000片段与DOX偶联。利用透射电子显微镜对纳米胶束的粒径和形貌进行表征，如图3-A～B所示，PTDOX-M及PCDOX-M胶束呈圆球形，分散均匀，粒径约30.92、32.12 nm。证明所述2种纳米胶束的成功合成，并且两种胶束的粒径和形态没有显著差异。

图1 mPEG2000-TK-DOX的制备Figure 1 The synthesis of mPEG2000-TK-DOX

图2 HOOC-TK-COOH（A），PEG2000-TK-COOH（B），PEG2000-TK-DOX（C），PEG2000-C-DOX（D）的核磁氢谱Figure 2 1H NMR spectra of HOOC-TK-COOH（A），PEG2000-TK-COOH（B），PEG2000-TK-DOX（C），PEG2000-C-DOX（D）

图3 成PTDOX-M（A）and PCDOX-M（B）的透射电镜图Figure 3 The TEM of PTDOX-M（A）and PCDOX-M（B）.（Scale Bar=100 nm）

2.2 超声触发ROS的产生及DOX释放

如图4-A所示，PBS在超声后，525 nm处的荧光强度不产生荧光强度的变化，但DOX、PTDOXM及PCDOX-M在525 nm处的荧光强度随着超声时间的延长而增加。结果表明，在超声辐射下，DOX作为声敏剂可以产生ROS。如图4-C所示，PTDOX-M在未超声时，几乎没有DOX的释放。然而随着超声时间的增加，DOX的释放增加，超声5 min后，48 h的累积释药率达到了43%。然而超声辐射前后PCDOX-M并未检测到DOX的差异性释放。这是由于超声产生的ROS使TK键断裂，DOX从胶束中释放。

图4 超声触发产生ROS（A）；超声触发DOX从PCDOX-M（B）and PTDOX-M（C）中释放Figure 4 US-triggered ROS generation（A）；US-triggered DOX release from PCDOX-M（B）and PTDOX-M（C）

2.3 PTDOX的体外和体内抗肿瘤研究

如图5所示，PTDOX-M和PCDOX-M在无超声时对4T1细胞几乎没有毒性。单纯超声（3 min，1 MHz，2 W/cm2，50%占空比）也不会对细胞造成损伤［27］。在超声处理下，PTDOX-M对细胞的存活抑制率较PCDOX-M和游离态DOX高。结果表明，超声并不对细胞产生毒性作用，然而PTDOX-M在超声前，对4T1细胞毒性作用低，具有一定的安全性，超声后，细胞毒性明显增强，这是由于超声产生的ROS与TK断裂后释放的DOX对细胞的双重损伤作用所致。

图5 超声或不超声处理时的DOX、PTDOX-M和PCDOX-M对4T1细胞毒性Figure 5 In vitro cytotoxicity of DOX，PTDOX-M and PCDOX-M against 4T1 cells with or without US irradiation

治疗期间每隔2 d用游标卡尺对肿瘤体积进行测量。治疗结束后对各组的小鼠的肿瘤相对体积及相对体重进行测量。如图6所示，相对于其他的对照组，PTDOX-M+US组的肿瘤抑制作用最强，肿瘤抑制率达到86.2%。各组荷瘤小鼠相对体质量没有差异。结果说明，PTDOX-M介导的声动力-化学疗法可以显著抑制4T1肿瘤的生长。

图6 各组老鼠的体重变化情况；声动力-化疗联合治疗对4T1移植瘤的生长移植情况。Figure 6 The tumor weight after varies treatment；Sonodynamic-chemotherapy combined inhibition of 4T1 tumors growth after i.v.injection of free DOX or PTDOX-M or PCDOX-M

3 讨论

为了克服癌症传统治疗方法的局限性，一些新型非入侵的治疗方法，如光动力（PDT）［28］、声动力（SDT）［2］、光热（PTT）［15］等正在进行广泛的临床前研究。目前研究发现，声动力治疗被认为可以有效地诱导癌细胞死亡和抑制实体肿瘤生长。声动力治疗（SDT）作为一种新兴、非侵入性的治疗方法，具有深的组织穿透能力、非电离性、高时空可控性和低成本［16］。典型的声动力过程中，超声激发肿瘤部位表层或深层的声敏剂产生活性氧成分（ROS）诱导癌细胞凋亡或坏死，导致癌细胞死亡［29］。根据已有研究表明，超声和声敏剂是声动力过程中必不可少的组成部分。其中，声敏剂的物理、化学/生物稳定性，如亲疏水性、稳定性、光学性质，是影响声动力治疗效果的重要因素。相对于已报到的小分子声敏剂，本项目制备的DOX前药胶束能有效提升DOX的亲水性和肿瘤富集能力，有助于增强DOX介导的癌症声动力治疗效果。

研究发现，声动力治疗虽然在各种癌细胞中都显示出了良好的结果，但在体内抗肿瘤的效果还无法满足临床需求。声动力过程中产生的活性氧成分半衰期短（10～320 ns），辐射半径小（<20 nm），导致癌细胞内的活性氧成分累积量少，难以对癌细胞产生显著的损伤。而声动力联合化学疗法治疗有望解决此问题［30］。化学疗法过程中，化疗药物，如DOX在细胞内可以长时间持续产生ROS，诱导细胞DNA、蛋白、脂质损伤，有望联合声动力治疗提升体内抗肿瘤效果［31-32］。然而，化疗药物在肿瘤部位的低富集率和全身毒副作用是限制肿瘤化疗和化疗联合治疗的重要因素。尽管临床采用脂质体负载的DOX提升了药物的体内循环时间，但是治疗效果和毒副作用依然无法令人满意。本项目提出应用外源性超声触发化疗药物在肿瘤部位精准释放，能有效降低DOX的毒副作用。

针对上述情况，本项目利用氧化响应键TK将疏水性DOX和亲水性mPEG2000通过酯化反应链接，形成两亲性聚合物mPEG2000-TK-DOX。在此基础上制备了一种氧化响应的DOX前药胶束（PTDOXM），用于联合声动力-化学疗法治疗癌症。该前药胶束中，DOX不仅是化疗药物，也是声敏剂。在无超声激发时，PTDOX无ROS产生，也无DOX释放。在超声辐射下，DOX前药胶束会产生大量的ROS，触发胶束中的TK裂解，诱导DOX从胶束中释放，而非氧化响应的PCDOX-M中无DOX释放。体内抗肿瘤研究发现，在超声触发下，与非氧化响应的PCDOX-M相比，PTDOX-M可以显著抑制体内肿瘤生长。同时，上述2种DOX前药胶束对小鼠的体重无影响。