皮肤癣菌的分子鉴定技术研究进展

石媛漾 潘炜华 廖万清 陈显振 蔡刘阳

(1.海军军医大学上海长征医院皮肤科，上海 200003；2.上海市医学真菌分子生物学重点实验室，上海 200003)

前 言

皮肤癣菌是临床最常见的真菌感染之一。全球范围内有20%～25%的人口感染浅部真菌，其中以皮肤癣菌感染为主[1]。目前已报道的皮肤癣菌有50余种，其中具有人类致病性的有20余种[2]。随着社会的发展，饲养宠物的热潮、热带地区移民的迁入、人口老龄化的趋势和免疫抑制剂的使用等多种因素正使得皮肤癣菌病的发病率不断增长[3]。皮肤癣菌病常伴有不同程度的瘙痒，严重影响身心健康和生活质量。目前皮肤癣菌病致病菌种的鉴定仍以直接镜检和真菌培养的经典方法为主，耗时长，结果受主观因素影响大，因此，快速准确地鉴定致病菌种，能为精准治疗提供依据。新兴的分子鉴定技术具有快速、简便、特异的优点，能够更好地满足临床诊治需要。然而，皮肤癣菌病分子诊断仍面临三方面挑战[4]：①DNA提取浓度低；②标记基因或组合分辨率不够高，分类体系尚不完善；③需要寻找敏感性或特异性更强的扩增体系。本文回顾了近二十年来国内外文献，介绍皮肤癣菌的分子鉴定技术的研究进展。

1 皮肤癣菌标记基因和分类学进展

相近的皮肤癣菌种属有相似的形态学特征，形态学鉴定费时费力，需要丰富的菌学知识，DNA测序为准确鉴定菌种提供了最佳途径[5]。由于从临床样本中提取的真菌DNA浓度有限，标记基因的选择和分子鉴定技术的方式决定了DNA检测的灵敏度[6]。

自20世纪以来，分子生物学的发展为皮肤癣菌的分类和进化提供了更多有价值的背景信息。目前的NCBI数据库存在大量不同名称的相同序列或错误识别的序列[7]，这个漏洞可以通过皮肤癣菌网(http://www.cbs.knaw.nl/dermatophytes/DefaultPage.aspx)上实时更新的ITS序列数据库来填补[8]。

根据最新的真菌分类证据[2]，皮肤癣菌划分为9个属，分别为毛癣菌属(Trichophyton)(16个种)、表皮癣菌属(Epidermophyton)(1个种)、奈尼兹菌属(Nannizzia)(9个种)、小孢子菌属(Microsporum)(3个种)、节皮菌属(Arthroderma)(21个种)、Paraphyton(3个种)、Lophophyton(1个种)、Cenomyces(1个种)、Guarromyces(1个种)，此分类体系是目前较为标准的一套皮肤癣菌分类体系。选择合适的标记基因有利于病原微生物的确切鉴定，例如，高度保守的CHS1基因一直是常用的标记基因[9-10]；28S rDNA序列虽区分度较低也可适用于皮肤癣菌鉴定[11]；现有的分子方法主要针对18S、ITS1、5.8S、ITS2和26S序列侧翼的rDNA区域；此外，DNA拓扑异构酶Ⅱ基因[12]、微卫星标记[13]、β-微管蛋白(BT2)[14-15]、翻译延长因子1-α(Tef-1α)[14,16]、钙调蛋白基因CaM[17]等都具有高度特异性。其中，网络数据库上ITS序列上传量最丰富，因此有研究者把基于ITS的测序技术当作皮肤癣菌系统发育分析和鉴定的“金标准”方法。但是，也有研究表明，对于相似相近菌种的精细分辨，ITS仍具有局限性[18]。

总的来说，单个基因划分物种边界的能力有限，寻找多个标记基因进行多重鉴定和反复验证是必不可少的。

2 基于PCR的分子鉴定技术

2.1 常规聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)

常规PCR是使用最广泛、简单、经济的一种分子技术。皮肤癣菌的鉴定，主要选择ITS、rDNA、拓扑异构酶Ⅱ或CHS1等序列进行PCR扩增[19]。Gordon等[3]研究了107个临床样本，结果显示常规PCR能够应用于区别皮肤癣菌和其他混合感染的微生物。但是，常规PCR对温度条件、实验室空间和设备的依赖性强，结果受多种因素影响，已逐渐地被更先进的技术替代。

2.2 荧光实时定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)

RT-PCR是一种使用不同的特异性引物，结合探针作为染料，直接从临床样本中检测出一种或多种皮肤癣菌的分子方法。它的特点是处理时间短、污染率低，缺点是成本较高。Bergmans等[20]和Alexander等[21]基于ITS1引物，区分了包括毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属的11种皮肤癣菌，将皮肤癣菌鉴定精确到属种水平。另一项研究报道，RT-PCR使临床样本中皮肤癣菌的检测率显着提高到97%[22]。Miyajima等[23]在研究甲真菌病时开发了一种新的RT-PCR方法，成功检测出红色毛癣菌、须癣毛癣菌和多种非皮肤癣菌致病真菌。

2.3 巢式PCR(nest-PCR)

巢式PCR技术由初级和次级扩增组成，初级扩增的产物用作次级扩增的模板，以提高特异度和灵敏度[24]。据文献数据，巢式PCR结合CHS1基因诊断皮肤癣菌病的灵敏度为83.8%[25-26]。另有研究利用巢式PCR结合多个标记基因(ITS+ITS1+5.8S rRNA基因+ITS2)检测猫和犬组织样本中的皮肤癣菌，结果显示更高的特异度(94.4%)和灵敏度(94.9%)[27]。巢式PCR也有其缺点，Petinataud等[28]指出，因其涉及两次扩增步骤，污染风险更高。

2.4 多重PCR(mutiplex-PCR)

多重PCR指的是在单个PCR反应体系中快速完成多个靶序列扩增，以提高检测效率。多重PCR实验设计的关键是避免引物二聚体的产生，从而避免扩增失败和非特异性扩增。Arabatzis等[29]开发了双重RT-PCR，结合ITS1和ITS2序列，直接检测临床样本中的皮肤癣菌。丹麦的Statens Serum研究所[30]开发了一种商业双重PCR试剂盒，针对CHS1和ITS2基因，能够在5 h内从指甲样本中检测出红色毛癣菌。据报道，多重PCR技术鉴定指甲样本中的红色毛癣菌和须癣毛癣菌的敏感性为97%，而传统方法的敏感性为81.1%[19]。当前在许多国家，双重PCR主要用于检测甲真菌病和足癣中的红色毛癣菌[12，20]。

2.5 聚合酶链式反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)

聚合酶链式反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)是一种扩增含有小规模遗传变异的核酸的特定片段，然后用适当的限制性内切酶处理，根据片段的电泳结果进行鉴定的技术。早期，PCR-RFLP用于鉴定组织样本中特定的真菌，例如毛癣菌属、镰刀菌属或曲霉属。目前，PCR-RFLP已经能够直接从指甲、皮肤或头发样本中成功检测到红色毛癣菌和须癣毛癣菌[31]。一项研究指出，PCR-RFLP在74%的甲真菌病培养阴性样本中检测到毛癣菌属和12种非皮肤癣菌[32]。PCR-RFLP技术简便、经济、不依赖先进的仪器设备，但是需要限制性内切酶、操作复杂以及耗时费力的缺点限制了其在临床上的应用[33]。

3 恒温核酸扩增技术

近年来，恒温核酸扩增技术快速发展，该技术将反应过程维持在恒定的温度，通过添加不同活性的酶和特异性引物来达到快速扩增核酸的目的。当前已研发的恒温核酸扩增技术分为两大类[34]：①通过增加核酸浓度从而加强分析结果的信号，如LAMP、NASBA、HDA、EXPAR、SDA、RPA、RCA；②无需改变核酸浓度就能加强分析信号，如EASA、ICSDP、HCR、CHA等。

与PCR相比，恒温核酸扩增技术表现出更高的特异度和灵敏度，目前已成功地应用于分子生物学领域。LAMP是目前应用最广泛的筛选技术，用于鉴定皮肤癣菌、结核分枝杆菌、禽流感病毒[35-36]、疟原虫[37]等病原体；NASBA用于检测mRNA和microRNAs[38]；EXPAR能检测蛋白质大分子[39-40]；SDA可以分析含有多种成分的样品，如含有细菌和病毒的人体血液[34]；RPA能直接在生物样品中检测阳离子以检测不同的病原体[41]。RCA[42]、HDA[34]广泛用于微生物感染的诊断，邓淑文等[43]利用RCA区分了头癣中的紫色毛癣菌和犬小孢子菌；HCR[44]技术，可用于测定细胞裂解产物中的microRNAs[45]和鉴定肿瘤细胞[34]；EASA技术，可用于提高荧光、电化学、核糖核酸、特异性酶分析的灵敏度[34]；新颖的Y结探针技术[46]和基于特定双链的技术[47]结合电化学法，可用于检测DNA、RNA和其他化学物质；CHA技术，可用于分析microRNAs[48]。

恒温扩增技术需要解决的问题在于减少非特异性反应的发生，减少假阴性或假阳性结果。目前恒温核酸扩增技术还处于研发和改善阶段，需要在现有基础上开发适用性更好、精确度更高、选择性更强的技术方法。

4 MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测技术)

MALDI-TOF MS是一种基于蛋白质组学的研究技术，能够直接测定蛋白质、多肽、核酸、寡糖等生物大分子。该技术通过分析和比对特定的微生物蛋白质图谱，能简便、快速、准确地鉴定微生物，且成本较低，近年来已经广泛应用于检测皮肤癣菌等真菌[49-50]。有研究者利用MALDI-TOF MS快速鉴别近300株皮肤癣菌，发现PCR和MALDI-TOF MS鉴定的符合率分别为99.3%和98.8%[49]。另一项研究[51]评估了2008至2015年间发表的十个项目，发现基于MALDI-TOF MS的皮肤癣菌鉴定的准确率在14%至100%之间，差异大的原因可能是样本的处理、提取步骤的操作和数据库的不足，再加上皮肤癣菌在分类学方面的演变。因此，对于皮肤癣菌等丝状真菌，MALDI-TOF MS的主要限制因素在于参考数据库的资料有限[52]，需要及时地持续地更新广谱数据库，才能更高效地鉴定皮肤癣菌。

5 总结与展望

皮肤癣菌病是临床最常见的皮肤真菌感染性疾病之一，经典诊断方法已经无法满足临床诊治的需求。新兴的分子鉴定技术具有高效、简便、准确的优点，为皮肤癣菌的快速鉴定和精准诊治带来了新的希望，同时，也有利于寻找分辨率更高的皮肤癣菌标记基因，完善皮肤癣菌的分类学体系，推动真菌分类学的发展。不同的分子鉴定技术有着各自的特点，常规PCR使用最广泛，简单，经济；RT-PCR处理时间短，污染率低；巢式PCR有着高特异度和灵敏度；多重PCR检测效率极高；PCR-RFLP非常简便；不断完善的恒温核酸扩增技术为核酸扩增和病原体鉴定提供了新途径；基于蛋白质组学的MALDI-TOF MS也能够高效特异地鉴定皮肤癣菌。不同的分子技术适用于不同的研究条件，应根据实际情况，结合经济条件、实验目的、研究策略等选择合适的技术方法。未来，基于分子鉴定技术的各类检测体系研发将是分子生物学发展的趋势，分子鉴定技术将不断进步，做到更快速、更简便、更准确、更实惠，帮助皮肤癣菌病患者解决病痛。