蛋白质组学在真菌生物膜中的应用研究进展

魏天琦 刘沐桑

(中国医学科学院皮肤病研究所， 南京 210042)

生物膜的形成对临床感染的发生发展产生重要影响[1]。真菌生物膜是由真菌细胞和菌丝以及胞外基质包裹形成的复杂群落，能够表现出比游离真菌更强的致病性和耐药性[2]。随着激素、免疫抑制剂等的广泛应用和各种人工植入物的使用，真菌感染的发病率显著上升，生物膜相关的感染及其耐药带来的治疗困难已成为严重的临床问题[3]。几乎所有致病真菌均能够形成生物膜和胞外基质，尤其在侵袭性真菌病中更为常见，目前关于生物膜的研究大多集中在白念珠菌和其他念珠菌属以及烟曲霉等致病真菌[2]。蛋白质组学技术在大规模水平上分离和鉴定蛋白质，近年来随着技术不断进步发展，已经在医学领域得到广泛应用，成为重要的研究手段之一[4]。目前在生物膜研究中，蛋白质组学不仅分离鉴定出了相关特征性蛋白，还证明了真菌生物膜耐药性可能与其生长过程中的某些与能量和代谢相关酶的表达上调或下调有关，例如增强了对表面相关蛋白的调节，活性氧的积累，氧化应激反应的上调等，但具体机制尚未完全阐明[5-6]。蛋白质组学技术通过提供真菌生物膜蛋白质全面和系统的描述，为研究其耐药相关蛋白提供了新的思路。本文将综述蛋白质组学技术的研究进展及其在真菌生物膜中的应用。

1 蛋白质组学

蛋白质是基因表达的最终产物，是生物结构和功能的主要载体。蛋白质组学则是在大规模水平上对所有蛋白质进行分离和鉴定，分析蛋白质表达、翻译后修饰、蛋白质间相互作用等[7]。蛋白质组学研究包括对蛋白质进行定性和定量分析，主要基于电泳(electrophoresis)和质谱(mass spectroscopy，MS)技术。随着研究范围和研究样本的不断扩大，蛋白质组学技术飞速发展，目前的研究重点已从最初的定性分析转移到高通量和高分辨率的定量蛋白质组学技术，并得到广泛应用。

1.1 基于电泳的蛋白质组学技术

二维凝胶电泳(2-DE)结合质谱分析是传统的蛋白质分离鉴定方法，但是存在检测的灵敏度低、低丰度蛋白质无法鉴定、极性蛋白无法回收等问题。随后，利用荧光标记标示的二维相差凝胶电泳(two-dimensional difference in-gel electrophoresis，2-D DIGE)的出现提高了蛋白质分离结果的重复性、可靠性和准确性，不过2-D DIGE缺点在于所需技术和设备复杂，自动化程度低，荧光染剂对小分子量蛋白不能完全标定等[8]。基于电泳的蛋白质分离技术存在一定局限性，容易受外界环境的干扰，对一些特殊性质的蛋白质不能很好地分离，并且操作繁琐，结果不稳定，灵敏度低，因此应用范围也受到一定限制[9]。

1.2 基于质谱的蛋白质组学技术

质谱是鉴定蛋白质的关键技术，随着研究不断深入，高通量质谱技术成为定量蛋白质组学的重要工具[10]。在微生物领域，质谱已经开始用于临床真菌和细菌的检测，展示出临床诊断应用的巨大潜力[11]。质谱分析蛋白质和多肽需要将样品进行离子化，目前主要应用的有基质辅助激光解吸离子化(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)和电喷雾离子化(electrospray，ESI)两种模式。一级质谱检测所有带电离子的质荷比和强度，形成一级谱图；二级质谱按照一定方式选择一级图谱中的母离子肽段，将其进一步解离，分析所形成的子离子的质荷比和强度[12]。相比于单一的相对分子量信息进行蛋白和多肽测定，通过二级质谱分析，其灵敏度和准确度均得到了提高。

定量蛋白质组学对蛋白质进行相对定量研究和绝对定量研究。相对定量技术分为体内标记的稳定同位素标记(SILAC)，体外标记的同位素编码的亲和标记(ICAT)、同位素交换以及用于相对和绝对定量(iTRAQ)/串联质量标签(TMT)，还有无标记定量的同量异位标签技术[13-14]。近年来，离子淌度功能(ion mobility)的引入实现了保留时间、质荷比、离子强度和离子淌度的四维数据采集，使得蛋白质组学进入4D时代[15-16]。离子淌度质谱让数据采集的速度和灵敏度都有了大幅度的提升，为高通量蛋白质组学提供了更强大的技术支持[17]。同时，质谱数据采集技术也在不断革新和发展，传统的数据依赖型(DDA)采集模式随机性、数据重现性较差[18]。新的数据非依赖型(DIA)的质谱采集模式通量高、重现性好、定量准，通过全扫描对所有母离子进行碎裂检测，以获得所有碎片离子信息，已成为当前最热门的质谱技术之一[19]。上述这些特征对于高通量蛋白质组的定量分析具有显著优势。

1.3 蛋白质组学数据库

随着质谱技术的发展，蛋白质组学已经获得海量的数据，建立了面向不同层次的不同需求的数据库，如包含原始质谱数据资源的PRIDE、PASSEL、Chorus数据库，肽段/蛋白质鉴定及定量的结果资源GPMDB、ProteomicsDB、MaxQB等以及蛋白质知识库UniProt系列数据库[20]。通过对上述数据进行整合、挖掘、利用，能够多角度、多途径地分析生物标本蛋白质，从而探究疾病的发生和发展，鉴定疾病相关的抗原/抗体、筛选诊断相关标志物、发现有效治疗靶点及评估临床疗效等。

2 蛋白质组学在真菌生物膜中的应用

随着生物膜相关的侵袭性真菌感染的发病率上升，与生物膜致病性和耐药性相关蛋白和分子机制的探讨已经成为近年来研究的热点。生物膜的形成参与了侵袭性真菌感染的致病过程，因此被认为是一种重要的毒力因子[1]。此外，真菌生物膜的一个显著特性就是对各种抗真菌药物的高度耐药性[3]。真菌生物膜耐药性形成的关键环节包括持留菌(persisters)在底物的附着和胞外基质(extra cellular matrix，ECM)的产生[21]。虽然不同真菌所形成的生物膜基质成分不尽相同，但是均与耐药机制相关，并参与形成生物膜细胞耐药的表型[2]。蛋白质组学研究提供了有关持留菌和胞外基质等生物膜中的蛋白质成分的定性、定量和功能信息，为深入探索生物膜相关真菌耐药机制提供了新思路。

2.1 在念珠菌生物膜中的应用

白念珠菌是一种常见的机会性致病菌，可引起侵袭性念珠菌病，在宿主和医疗植入物表面形成生物膜[21]。研究表明，白念珠菌在体内诱导的获得性耐药过程中，其形成生物膜的能力也有较大差异[22]。白念珠菌是最早开始用于生物膜胞外基质研究的真菌，也是医学真菌生物膜耐药机制研究的中心，其蛋白质组学研究成果最为丰富[23]。早期Thomas等[24]基于2D-PAGE的蛋白质组学提出白念珠菌浮游真菌和生物膜提取物的蛋白质图谱具有高度的相似性。随后Martínez等[25]使用2-D DIGE和基质辅助激光解吸离子化飞行时间串联质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)比较了浮游细胞、菌丝和生物膜的胞质蛋白和表面蛋白质，结果显示酵母细胞和菌丝具有独特的蛋白质谱。对胞质蛋白的比较分析显示，酵母细胞表现出较大差异；而在表面蛋白的比较分析中，生物膜则表现出较大差异。这些差异蛋白分别与呼吸、糖酵解和葡萄糖代谢、叶酸相互转化、氧化和应激反应以及多生物体相互作用有关。

Zarnowski等[26]较为全面地分析了组成白念珠菌生物膜基质的四类大分子物质，按干重计算，它们包含55%的蛋白质、25%的碳水化合物、15%的脂质和5%的核酸。随后他们对蛋白质成分进行了组学分析，结果表明白念珠菌生物膜基质中蛋白质的相对丰度远高于之前Thomas等的报道[24,27]，其中458个蛋白具有独特性，许多与碳水化合物和氨基酸代谢有关，这些与Faria-Oliveira等[28]鉴定出的蛋白质类别是相似的。Gil-Bona等[29]则通过蛋白质组学以及对所选突变菌株的功能分析，鉴定出了白念珠菌生物膜相关的蛋白，研究提示它们与细胞壁维持、渗透和对抗氧化应激有关。最近的一项定量蛋白质组学研究通过LC-MS比较鉴定了白念珠菌浮游细胞和生物膜的差异蛋白质，Munusamy 等[30]指出叶酸代谢、脂肪酸代谢和氨基酸(赖氨酸、丝氨酸和甘氨酸)的生物合成与生物膜相关途径密切相关，同时研究提出了白念珠菌生物膜蛋白与两个主要生物过程有关，即细胞内稳态和囊泡介导的转运。

Li等[31]通过LC-MS分析白念珠菌生物膜的持留菌蛋白质组，探究持留菌耐药机制，白念珠菌生物膜持留菌表现出特殊的蛋白质组学特征，鉴定到205种差异表达的蛋白质。其中参与糖酵解、三羧酸循环和蛋白质合成的关键酶明显下调，而许多与念珠菌生长、毒力和应激反应有关的重要蛋白质被大大上调。研究中还发现尽管存在高度诱导的细胞内超氧化物歧化酶，持留菌却对氧化应激具有耐受性。Truong 等[32]通过iTRAQ比较了单倍体和二倍体白念珠菌形成的生物膜持留菌蛋白质组，结果显示细胞壁过氧化物酶(alkyl hydroperoxide reductase 1，AHP1)在两性霉素B耐药性更弱的单倍体生物膜中表达较少，提示AHP1是决定白念珠菌生物膜持留菌抗两性霉素B 的关键性因素，揭示了AHP1可能通过维持持留菌的抗氧化能力，从而达到生物膜对两性霉素B抗性作用的新机制。这些研究结果表明，精细的代谢控制和协调的应激反应可能在介导念珠菌生物膜持留菌的存活和抗真菌耐受性方面发挥关键作用。

除了白念珠菌，其他念珠菌属真菌也能够形成生物膜，引起血行感染和导管或植入器械相关感染的念珠菌病，如光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌等[3]。Seneviratne等[33]应用2D DIGE和MALDI-TOF-MS比较浮游细胞和生物膜状态下光滑念珠菌的差异蛋白质组谱，结果表明生物膜蛋白质组应激反应蛋白上调，糖酵解酶下调，而且在转录水平上也可以观察到类似的趋势。这一发现提示光滑念珠菌生物膜可能通过表达更多的应激反应蛋白来增强自身的抗真菌耐药性。

上述蛋白质组学研究成果使我们对念珠菌生物膜生长方式、耐药机制有了更深入的认识，也为研究抗真菌药物对生物膜的影响和未来寻找新的潜在药物靶点提供了方向。

2.2 在烟曲霉生物膜中的应用

烟曲霉感染免疫受损人群可以导致严重的侵袭性曲霉病，近年来其发病率逐渐上升，因其高致死率而被广泛关注[34]。烟曲霉在体内和体外均能形成生物膜，并表现出更高的致病性和耐药性[35]。目前蛋白质组学主要研究烟曲霉生物膜形成导致的细胞内外蛋白质成分变化，分析特征性蛋白质功能及其参与的代谢调控途径。Reichhardt等[36]研究分析了烟曲霉生物膜ECM的组成成分，数据表明ECM含有约40%的蛋白质、43%的多糖、3%的芳香族成分和高达14%的脂质。同时他们应用SDS-PAGE和MS技术鉴定了ECM蛋白质成分，发现其两种独特的蛋白质，过氧化氢酶B(catalase B)和Asp f2，其中Asp f2已经被证明是主要的过敏原。这两种蛋白质通常都是由细胞分泌出来的，并且都存在于烟曲霉的细胞表面或细胞外。而对于烟曲霉生物膜形成过程中的基因表达特点，Bruns等[37]对蛋白质组学和转录组学的研究表明，生物膜在形成早期需要能量，而在晚期成熟时则表现出能量代谢的减弱。在蛋白质组水平上，参与氨基酸生物合成、蛋白质降解和三羧酸(TCA)循环的蛋白质在生物膜菌丝中表现出差异调节。在生物膜成熟期间，糖酵解、柠檬酸循环三磷酸腺苷(ATP)合成酶水平随着时间的推移而降低，而乙醛脱氢酶的表达则显著上调。此外，参与次级代谢产物生物合成的蛋白质显著上调，随后的定量检测证明，其中胶质毒素的产生增多。这暗示了在体内条件下，烟曲霉生物膜胶质毒素的产生增加可能保护其免受宿主免疫系统的伤害，从而使之在慢性肺部感染中持续存在。此外，在烟曲霉生物膜耐药机制方面，Ranjith等[38]通过对伏立康唑处理的烟曲霉中外排泵的相位依赖性表达和活性的研究表明，外排泵(efflux pump)在烟曲霉生物膜中表达，并且提高其对唑类的耐药性。不仅如此，用伏立康唑处理烟曲霉还可以诱导外排泵表达。这些为曲霉病临床病例中的唑类抗真菌药的治疗失败提供依据。

目前的蛋白质组学研究显示了烟曲霉生物膜形成过程中某些蛋白质表达的变化，已经鉴定的功能蛋白的差异调节大多与能量代谢及氧化应激有关，这与念珠菌生物膜中的发现具有相似性，对进一步探究相关分子机制具有重要意义。

2.3 在其他病原真菌生物膜中的应用

除了上述提到的常见的生物膜相关致病真菌，其他酵母和丝状真菌也能引起生物膜相关感染，包括新生隐球菌、厚皮马拉色菌、毛孢子菌等病原真菌[3]。Santi 等[39]利用鸟枪蛋白质组学比较了新生隐球菌生物膜和浮游细胞之间蛋白质丰度的差异，结果在生物膜生长模式下50种蛋白质上调和81种蛋白质下调。其中上调2倍以上的蛋白质包括与氧化还原、蛋白水解和应激反应有关的蛋白质，如氧化还原酶、肽酶、过氧化氢酶、谷硫二硫还原酶、HSP70等。Yang等[40]使用TMT结合LC-MS/MS技术分析了两株毛孢子菌的蛋白质组，分别来自初发和复发的系统性播散性毛孢子菌病的患者，共鉴定到597个差异表达蛋白，其中在复发性患者来源菌株中2种热休克蛋白显著上调，提示可能与生物膜形成相关。

这些研究证据提示不同真菌在生物膜形成时可能具有相似的蛋白质组变化趋势，暗示可能与某些共同的分子途径相关，并在致病过程中发挥作用，参与宿主相互作用或形成耐药趋势，这对发现不同真菌共同的致病机制和对同类抗真菌药的耐药机制具有重要意义。

3 真菌生物膜与固有免疫识别

生物膜中的多糖成分不仅构成细胞壁的重要组分，也存在于生物膜ECM中[23]。Beauvais等[41]对曲霉生物膜基质进行了初步研究，发现其含有半乳甘露聚糖、α-1,3-葡聚糖、蛋白质、多元醇和黑色素，其中半乳甘露聚糖存在于细胞壁和基质中，而α-1,3-葡聚糖主要位于细胞外菌丝表面附近。真菌细胞壁中的β-1,3-葡聚糖在真菌中较为保守且广泛存在，并作为病原体相关分子模式 (pathogen associated molecular pattern, PAMP)，能够被特定的模式识别受体(pattern-recognition receptor, PRR)识别[42]，如TOLL样受体家族的TLR2、TLR6，C型凝集素受体家族(CLRs)的Dectin-1、Dectin-2、甘露糖受体、CARD9(caspase recruitment domain 9)集合蛋白SP-A和SP-D[43]。这些PRRs对真菌细胞壁PAMPs的识别是抗真菌免疫、激活天然免疫反应和形成适应性反应的关键步骤，而真菌能够通过改变其细胞壁的组成掩盖或脱落主要的PAMP，如β-葡聚糖，来逃避宿主的免疫识别[44]。研究表明抑制β-1,3-葡聚糖的合成会促进PAMPs的暴露，进而激活免疫防御机制，而α-葡聚糖主要作为毒力因子是否能被PRR特异性识别目前尚不清楚[45]。

4 总结与展望

蛋白质组学技术在蛋白质水平上研究生物膜的生活方式、致病性、耐药机制及与药物的相互作用，已经取得了显著进展[46]。基于定性和定量蛋白质组学通过研究真菌胞外基质和持留菌，绘制了多种真菌生物膜的特征性蛋白图谱，提出其与游离真菌在蛋白质组上的差异，并鉴定出了相关蛋白质功能，为了解真菌生物膜相关感染的发病机制和抗真菌药物开发等奠定了基础。然而，生物膜形成过程中涉及的生物大分子还包括某些非蛋白成分[23]，蛋白质组学并不能揭示与耐药性相关的蛋白质的变化与某些非蛋白质成分之间的相互关系。同时，生物膜的形成是一个动态变化的过程，对于生物膜发育过程中不同时期蛋白质组学变化的研究也还甚少。研究真菌生物膜不同发育阶段的蛋白质表达谱以及药物作用下的生物膜蛋白质组，将有助于进一步发现调节生物膜形成的分子机制，并为研究其耐药性提供新思路。在介导或逃逸宿主免疫过程中，真菌细胞壁中的多糖成分作为PAMP的作用不容忽视，并且参与生物膜的形成。近年来的研究发现了β-葡聚糖在真菌感染天然免疫防御的中心作用，以及α-葡聚糖作为真菌毒力因子的功能。目前，人们已经从真菌中鉴定出多种α和β-葡聚糖合成所必需的多种酶，并对细胞壁葡聚糖合成的研究机制进行了大量的研究，不过仍有许多问题未得到解决[47]。通过蛋白质组学研究方法寻找或锚定病原真菌利用哪些蛋白成分负责转运多糖类PAMPs至生物膜上，并通过何种酶类加以修饰，将可能成为今后研究中需要关注或解决的问题。此外，目前大多数研究的是体外生物膜，在体内或临床环境中形成的生物膜的蛋白质组数据仍较少，体内生物膜的样本获取和蛋白质研究对于生物膜的蛋白质组学来说将是一个新的挑战。蛋白质组学在真菌生物膜研究中整体描述了基因转录的最终产物，对于蛋白质参与的代谢和调节网络，涉及相关基因和代谢水平的调控，未来多组学联合分析的参与将会带来更广阔的应用空间。