基于代谢组学的中药抗大肠癌研究❋

王雅楠，王奇钰，张治宽，邹 敏，屈莲平，石彩冬，高 峰

(1.甘肃中医药大学中医临床学院，兰州 730000；2.中国人民解放军联勤保障部队第九四○医院结直肠肛门外科，兰州 730050)

大肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居全球恶性肿瘤第三，死亡率位居第二[1]。据中国2015年癌症发病率和死亡率报告显示，中国大肠癌的年龄标准化发病率和死亡率分别为17.81/10万和8.12/10万，发病率和死亡率分别位居第四五位[2]，已成为癌症相关死亡的主要原因之一。在治疗大肠癌方面，中药具有逆转放化疗耐药性、调节免疫功能、诱导细胞凋亡、提高放化疗敏感性、降低放化疗毒副反应等明显优势[3-5]，近年来成为人们关注的热点。

大肠癌的早期诊断是影响病人预后的关键因素[6]。目前对大肠癌的有效诊断仍依赖于肠镜检查，但由于大肠癌早期的无明显症状、肠镜是侵入性检查的影响以及患者依从性差等因素[7，8]，使得早期诊断变得非常困难。因此，寻求更简易有效的筛查方法对大肠癌的早期诊断具有重要意义。随着生物技术的不断发展，尤其是与癌症有关代谢组学技术的快速推进，为大肠癌的诊断和治疗带来了新的可能。

1 代谢组学技术平台

代谢组学是位于基因组学、转录组学、蛋白组学的下游，通过对特定时间生物机体内所有内源性低分子量代谢物(<1.5 kDa)的定性及定量分析，研究这些代谢物含量变化与机体生理病理变化之间的关系，发现生物标志物以及寻找机体代谢机制的学科，属于系统生物学范畴[9-11]。以代谢组为研究对象，可以分析在不同的生理病理状态下，机体的血清/血浆、粪便、尿液、组织等样本内代谢物的差异，从而阐明差异性代谢物的功能。研究这些差异性代谢物在疾病发生发展过程中的作用，对疾病的诊断和治疗具有重要意义[12]。

目前核磁共振谱(nuclear magnetic resonance，NMR)和质谱(mass spectrum，MS)是常用的2种代谢物测定技术，在代谢物测定中占据主导地位[13]。NMR具有所需样本含量少、高度重复性和非破坏性，一度被公认为代谢物测定中的“金标准”。基于MS技术的代谢组学具有高选择性和高灵敏性的优势，可以识别代谢物并对所识别代谢物进行定性和定量分析[14，15]。近年来，由于人体复杂的生物系统以及需要满足血清/血浆、组织、尿液、粪便等多样本的测定，高通量[16]、高灵敏度[17]和高选择性[18]的代谢物测量技术，如气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)、液相色谱-质谱(liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS)、超高效液相色谱-质谱(ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UHPLC-MS)、超高效液相色谱-四极飞行时间-质谱等[19,22]得到了广泛的应用。

2 基于代谢组学的大肠癌代谢组研究

为了更加全面、准确地测量有关大肠癌代谢物差异，研究者分别选取不同的样本进行测定，各样本下具体代谢物的变化详(见表1)。

2.1 血清/血浆样本

大肠癌代谢组学研究中，以血清/血浆作为检测样本最为常见。在大肠癌血清代谢组学的临床研究中，Hashim等[20]对使用了不同分析平台、不同国家人群的9项血清/血浆代谢组学研究进行质量评价，结果显示糖酵解、三羧酸(tricarboxylic acid cycle，TCA)循环、无氧呼吸、蛋白质生物合成、脂质代谢和谷胱甘肽代谢的代谢物水平在大肠癌患者和对照样本之间有显著差异。在该9项研究发现的许多代谢物中，共有11种一致性代谢物，分别为丙酮酸、葡萄糖、乳酸、苹果酸、富马酸、3-羟基丁酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、肌酐和鸟氨酸。虽然使用不同的分析平台以及不同的人群样本，但其共同代谢物的一致性失调也为大肠癌代谢物层面的诊断和治疗提供了可能。Ariadna 等[21]通过高分辨率液相色谱质谱(liquid-chromatography coupled to high-resolution mass spectrom，LC-HRMS)法对转移性大肠癌患者和健康人血清的代谢物进行研究，发现患者和健康人血清中的内源性大麻素、鞘磷脂和甘油磷脂代谢有关的脂质种类代谢物水平出现差异，指出大肠癌的发展可能与这些脂质的种类变化相关。Lee等[22]通过LC-MS法对大肠癌患者术前术后血清标本之间代谢产物的差异性进行对比，发现鞘脂代谢途径、类固醇生物合成途径、精氨酸和脯氨酸代谢途径中的代谢物出现了显著差异，且术后患者血清中腐胺浓度明显低于术前，提示腐胺可能与肿瘤的发生发展有关。Gu等[23]通过核磁共振氢谱(1H nuclear magnetic resonance，1H-NMR)对大肠癌患者和健康者血清的代谢物进行研究分析，发现大肠癌患者相比健康人血清主要的异常代谢途径为糖酵解，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，谷氨酰胺和谷氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径，并报道了大肠癌患者的代谢标志物。这些异常代谢途径和代谢标志物与Li等[24]在大肠癌早期代谢标志物研究中的报道相一致，表明这些代谢标记物有望用于对大肠癌的诊断以及作为辅助治疗指标。

2.2 组织样本

外科手术中采集的组织样本也是大肠癌代谢组学研究中的重要部分。在大肠癌组织代谢组学的临床研究中，KIBI等[25]通过GC-MS和LC-MS方法对10例大肠癌患者的肿瘤和正常黏膜组织进行代谢组学分析，研究发现组织样本中与糖酵解、磷酸戊糖途径、谷胱甘肽生物合成和色氨酸、犬尿氨酸途径有关的中间产物含量明显升高。该研究还发现，与细胞增殖至关重要的色氨酸含量明显降低，认为癌细胞可能通过抑制色氨酸来完成自身的快速增殖。Li等[26]使用1H-NMR法对小鼠大肠癌(CT-26)肺转移模型代谢谱的研究中发现，糖酵解、TCA循环、谷氨酰胺分解、胆碱代谢和丝氨酸生物合成途径中存在代谢紊乱，模型组组织样本较正常组组织样本中乳酸的含量显著增加，提示乳酸可能有利于增加癌细胞的转移能力。Satoh等[27]在大肠癌的正常和肿瘤组织代谢物研究中也发现，肿瘤组织较正常组织中乳酸含量增加，谷氨酰胺代谢水平下降，这2项研究结果呈现一致性[26，27]，表明这些途径中相关代谢物的差异性变化可能用于大肠癌发生肺转移的诊断指标，为诊断大肠癌的肺转移提供了依据。

2.3 粪便/尿液样本

在有关大肠癌粪便代谢组学的临床研究中，Clos-Garcia等[28]在使用UHPLC-MS法对大肠癌患者粪便样本代谢组的研究中发现，大肠癌患者粪便中胆固醇酯和鞘磷脂水平的差异。Kim等[29]通过UHPLC-MS法对大肠腺瘤患者粪便代谢组学特征的研究中发现，腺瘤患者粪便代谢物中脂质代谢、鞘磷脂代谢、次级胆汁酸、嘌呤代谢以及多不饱和脂肪酸均异常于正常人。Yang 等[30]通过GC-MS法对大肠癌患者粪便代谢组的研究中发现，蛋白质生物合成、氨循环和半乳糖代谢途径中的代谢物异常于正常人。该研究还报道了在大肠癌患者粪便中，减少的代谢物(糖和长链脂肪酸)的数量比增加的代谢物(氨基酸和多胺)数量更多，说明正常人较大肠癌患者具有更好地维持碳水化合物代谢和肠道内环境的能力。值得注意的是，该研究中报道的大肠癌患者粪便代谢物中脱氧胆酸含量较正常人代谢含量降低，这与其他报道不一致[29-31]。脱氧胆酸被证实与大肠癌肿瘤的发展相关，具有促肿瘤作用[32]。在有关大肠癌尿液代谢组学的临床研究中，Kim等[33]使用NMR法对晚期大肠腺瘤和早期大肠癌患者的尿液标本进行代谢组学研究，发现丙氨酸、牛磺酸和3-氨基异丁酸有可能是成为准确诊断的标志性代谢物，这些代谢物都与能量代谢途径有关。

在大肠癌代谢组学研究中，在不同的检测标本下发现，大肠癌患者和健康人的代谢物、模型组与正常对照组代谢物之间均存在差异性。本研究总结了基于代谢组学研究方法得到的潜在大肠癌差异性代谢物(见表1)。

表1 大肠癌差异性代谢物总结比较

本研究总结基于代谢组学技术分析大肠癌代谢物代谢水平变化的文献共15篇，其中血清样本7篇，组织样本3篇，粪便样本4篇，尿液样本1篇。通过总结文献发现，大肠癌患者与正常人、模型组与正常对照组体内代谢物含量均具有明显差异。文献中出现频率≥3次的一致性差异代谢物有6种，与正常组比较丙酮酸、乳酸和谷氨酸代谢水平升高，色氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺代谢水平降低。文献中出现2次的一致性代谢差异物有15种，其中葡萄糖、3-羟基丁酸、肌酐、苏氨酸、胆碱、醋酸、胸腺嘧啶、黄嘌呤、腺嘌呤、前列腺素E2、异亮氨酸、丝氨酸和丙氨酸代谢水平在患病后显著升高，而患者大麻素和琥珀酸代谢水平降低。结果提示，这21种差异性代谢物有可能作为潜在的大肠癌生物标记物，也可能作为潜在的抗大肠肿瘤药物的药效评价标记物，用于大肠癌的诊断及治疗。通过相关代谢路径分析发现，大肠癌细胞主要通过影响体内糖酵解、TCA循环、蛋白质代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢和磷脂代谢等一种或多种代谢途径来完成自身能量的供给和快速增殖。

3 基于代谢组学的中药抗结直肠肿瘤机制研究与药效评价

3.1 紫草素

Chen等[34]研究了紫草素对裸鼠移植瘤模型的抗肿瘤作用，并报道了紫草素抗结肠癌的代谢作用机制。对体外使用紫草素干预的SW-620大肠癌肿瘤细胞实验组进行代谢组学分析，结果提示紫草素通过嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢、精氨酸生物合成和β-丙氨酸代谢途径影响SW-620细胞生长。利用SW-620细胞建立裸鼠移植瘤模型开展的体内研究发现，紫草素能够显著抑制小鼠肿瘤生长，进一步的代谢组学分析鉴定出23种差异性显著的代谢物。对比发现，在紫草素的干预下，腺嘌呤和腺苷两种代谢物在体内和体外的嘌呤代谢均呈现下调趋势。结果证实，紫草素具有明显的抗大肠癌肿瘤作用，其作用机制可能与嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢、氨基酸代谢和甘油磷脂代谢紊乱有关。

Chen等[35]研究了紫草素对结直肠患者的异种移植小鼠模型的抗肿瘤作用。对经紫草素治疗组和模型组小鼠的肿瘤组织和血清进行代谢组学分析，发现与模型组比较，治疗组小鼠组织中有32个差异性代谢物，其中20个上调12个下调，血清中有20个差异性代谢物，其中8个上调12个下调。组织和血清中的一致性代谢物为黄嘌呤、次黄嘌呤、尿苷、胆碱和马尿酸。该实验结果表明，紫草素的抗肿瘤作用与精氨酸生物合成、嘌呤代谢、氨基酸生物合成和谷胱甘肽代谢紊乱有关，可见紫草素可能通过这些代谢途径抑制大肠癌肿瘤生长。

3.2 黄芪-温郁金(astragalus membranaceus-curcuma wenyujin，AC)药对

Sun[36]等研究了不同比例AC对小鼠结肠癌肿瘤的抑制作用，发现AC比例为2∶1时抑瘤效果最为显著。AC干预治疗15 d的结肠癌小鼠组和未经处理的对照组小鼠血清代谢组学对比分析结果显示，AC干预能够使多项指标回调，其中结肠癌小鼠血清中亮氨酸、全反式维甲酸水平升高，次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基黄嘌呤水平下降，表明AC的抗肿瘤机制与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、氨基酰转移核糖核酸(transfer RNA，tRNA)的生物合成、咖啡因代谢和视黄醇代谢途径相关，并以回调该途径内的代谢物水平来发挥抑制结肠癌细胞生长和转移的作用。

3.3 金复康口服液

邱云平等[37]研究了金复康口服液对二甲肼诱发的大肠癌癌前病变作用机制，通过尿液代谢组学分析，发现与正常组比较，模型组中15个代谢物具有显著差异，实验组仅有4个代谢物具有显著差异。模型组与实验组比较，琥珀酸、柠檬酸、乌头酸、异柠檬酸、吲哚乙酸、色胺、5-羟基吲哚乙酸、腐胺和亚精胺代谢水平升高，被调控的这些差异性代谢物与TCA循环、色氨酸代谢和多胺代谢等途径有关。

3.4 苦津茶

BI等[38]研究了苦津茶对偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)诱导大鼠结直肠癌前病变的作用机制，该研究分为对照组、AOM组和实验组(AOM+苦津茶组)，在第12周末收集每只大鼠24 h尿液进行代谢组学分析，结果显示与对照组比较，AOM组中9-癸烯酰肉碱、辛酰基葡萄糖醛酸水平升高，肌酸、5-甲基脱氧胞苷、尿酸、吲哚-3-羧酸、马尿酸、对甲酚葡萄糖醛酸水平降低，而在实验组治疗后代谢物出现逆转趋势，表明苦津茶对大肠癌前病变具有显著改善作用。其作用机制可能与嘌呤代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、苯丙氨酸代谢和色氨酸代谢等途径有关。

3.5 五达颗粒

Wang等[39]探讨了大肠癌患者腹腔镜术后联合五达颗粒对大肠癌的治疗作用。对大肠癌病人术前和术后联合五达颗粒治疗3 d后的血清样本进行代谢组学分析，与术前组比较，治疗组中花生四烯酸、丙酮酸、亮氨酸水平下降，亚麻酸、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸水平上升，特别是花生四烯酸水平恢复至与健康者接近。经相关代谢途径分析，五达颗粒调控的这些差异性代谢物，主要涉及花生四烯酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、α-亚麻酸代谢、丙酮酸代谢和组氨酸代谢等一个或多个途径，从而发挥治疗作用。

4 结语与展望

通过总结基于代谢组学技术分析大肠癌患者体内代谢物差异的有关文献，结果显示大肠癌的潜在生物标记物有丙酮酸、乳酸、谷氨酸、色氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺等21种代谢物。这些代谢物不仅能为大肠癌的前期诊断和筛查提供可能依据，也可能作为抗大肠癌中药药效生物标记物，用于大肠癌患者的早期和术后联合治疗。中药抗大肠癌作用的相关代谢分析表明，中药所调控的途径涉及氨基酸代谢、嘌呤代谢、糖酵解、TCA循环、甘油磷脂代谢和脂质代谢等一个或多个代谢途径，从而发挥抗肿瘤作用。这些研究结果不仅从代谢物层面验证了抗肿瘤中药的多途径协同作用特点，也与中医的整体观念和辨证论治理念相吻合[40]，完善了中药抗大肠癌肿瘤的代谢机制。

代谢组学为我们从代谢层面认识大肠癌提供了新的思路方法，一定程度上也为中医药和现代医学之间对大肠癌的治疗搭建了桥梁，促进了中西医的联合，但仍存在一些不足。一是在利用代谢组学技术对大肠癌患者的样本进行分析时，无法精确控制客观影响因素，如患者的饮食习惯、吸烟、体质等；二是基于代谢组学技术，文献中虽然报道了许多差异性代谢物，但部分代谢物在不同研究中的改变不一致，如亮氨酸[24,26,39]、脱氧胆酸[29，30，31]等。不同的研究方法、不同地域的研究对象以及不同的饮食习惯都是造成这些差异的原因；三是在有关中药对大肠癌抑制作用的研究中，多数都通过差异性代谢物的代谢水平和有关代谢途径来阐明药物作用机制，未联合蛋白组学、转录组学等方法从差异蛋白间的作用关系来探讨药物的作用机制。若能多组学整体性的分析药物作用机制，不仅更加贴合中医学“整体观念”的理念，并且能多角度、多层面地去阐明药物的作用机制，结果将更加令人信服。