甲基化修饰与胶质瘤

张旭，曾智，熊晓星*

（武汉大学人民医院1神经外科，2病理科，武汉 430060）

胶质瘤是一类生物学和临床特征复杂的异质性脑肿瘤，恶性程度高、预后差[1]。外科手术联合替莫唑胺（temozolomide, TMZ）化疗及病变区放疗是目前临床常用的治疗方式，但综合治疗效果不理想，急需进一步探究胶质瘤发生发展的机制，并开发新的治疗方式[2-4]。甲基化修饰是表观遗传学修饰的一种，调节细胞内遗传物质的稳定与表达。研究表明，遗传分子的甲基化修饰参与多种肿瘤相关通路的调控。细胞内的DNA、RNA及蛋白质均可受甲基化调控，其具体机制及其对胶质瘤的影响还需更深层的探究[5]。本文对甲基化修饰在肿瘤细胞内对遗传物质进行调节的机制、该表观遗传学修饰方式对胶质瘤的影响及其临床治疗应用前景展开综述。

1 甲基化的调节机制

DNA、RNA及组蛋白共同组成生物遗传大分子，其保守甲基化有助于维持基因复制、修复及表达的稳定，甲基化模式的改变对细胞的分化与发展有很大的影响。多种甲基化及去甲基化的酶构成了多样的通路，互相影响，对细胞内的甲基化进行动态的调节[6]。

1.1 DNA甲基化

DNA 甲基化主要发生在回文CpG二核苷酸上，哺乳动物体内70%～80%的CpG位点由甲基化修饰[7]。DNA上富含CpG位点的区域，被称为CpG岛，大量位于基因5’端的启动子区域。增强子、沉默子等基因表达元件也富含CpG位点[8]。5-甲基腺苷（5-mc）的合成是DNA甲基化调控最常见的机制，在该过程中，DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases, DNMT），主要是DNMT1，DNMT3A等，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)为甲基供体，将甲基基团结合到回文CpG二核苷酸的胞嘧啶的第五位碳原子上[9,10]。另一方面，10-11易位（TET）加双氧酶（ten-eleven translocation (TET)dioxygenases）氧化DNA上修饰的甲基，主导DNA的去甲基化[11]。细胞通过对甲基基团的转移与氧化，动态调整DNA甲基化过程。

1.2 RNA甲基化

甲基化是真核生物中最常见的 RNA 修饰方式。作为细胞遗传信息传递的信使，mRNA甲基化机制的研究也正在深入开展[12]。N6-甲基腺苷（m6A）的合成是mRNA修饰的主要方式，这种方式所调控的基因参与细胞分化、肿瘤进展等生物学过程。m6A mapping及Mazter-Seq等技术展示了甲基化修饰过程中被修饰的RNA链上的大量m6A结合位点，为揭示mRNA甲基化机制提供了巨大帮助[13]。在细胞核内，mRNA转录形成后，m6A的合成与消除就同时动态地发生着。甲基转移样酶3（methyltransferase-like 3, METTL3）是合成反应中的关键酶，与其异构适配体METTL14形成的异二聚体复合物合成mRNA上几乎所有的m6A。m6A结合细胞核与细胞质中含有YDH片段的蛋白，如YDHDC1，YDHDC2，YDHDF，维持mRNA的稳定及调控其剪切、转运、翻译等过程。另一方面，细胞内脂肪团与肥胖相关基因（fat mass and obesity-associated gene, FTO）及去甲基化酶AlkB同族体5（AlkB Homolog 5, ALKBH5）具有消除RNA甲基化的作用，进而降低m6A修饰的mRNA的稳定性[12]。

1.3 组蛋白甲基化

组蛋白与DNA组成共同核小体，组蛋白不仅起到维持DNA双螺旋的作用，还是协调染色质外部调节可及性的共价结合位点。组成核小体的组蛋白包括H2A，H2B，H3，H4，其中对H3甲基化的研究最广泛[14]。组蛋白氨基酸旁链的赖氨酸与精氨酸的N末端，是包括甲基化、乙酰化及泛素化在内的多种转录后修饰的发生位置。赖氨酸（K）是组蛋白翻译后甲基化的主要基团，可以结合多个甲基基团，形成单甲基化、双甲基化或三甲基化，而精氨酸（R）可以形成单甲基化及对称或非对称的二甲基化[5]。组蛋白H3K9、H3K27和 H4K20甲基化往往预实着染色质构象封闭和基因沉默；相反，H3K4、H3K36和 H3K79甲基化则预示着染色质构象开放和基因表达[15]。组蛋白甲基转移酶（histone methyltransferases,HMTs）是组蛋白甲基化的主要酶，包括EZH2、G9a、MLL1等，催化不同形式的组蛋白甲基化。细胞内也有组蛋白去甲基化酶（histone demethylases,HDMs）催化甲基化的组蛋白去甲基化，所以组蛋白的甲基化也是一个动态平衡的过程[16]。

1.4 甲基化调节的整体特点

甲基化与去甲基化的过程在细胞内同时发生。近年来发现了一些可以酶促不同种类分子甲基化过程的酶及复合酶体，例如人核仁蛋白1（human nucleolar protein 1）能同时催化RNA及组蛋白的甲基化[17]，DNMT2能同时催化DNA和RNA[18]。甲基供体SAM给出甲基后，产物s-腺苷高半胱氨酸（s-adenosylhomocysteine, SAH）会转而抑制甲基转移酶的活性，令甲基化成为一个具有负反馈、自限性的调控过程[5]。以上现象都表明，甲基化是整体而动态的调控过程，其机制在疾病的治疗中具有应用潜力。

2 甲基化在胶质瘤中的作用

甲基化失衡是大部分恶性肿瘤的特征之一，诸多研究揭示了甲基化调控的异常在胶质瘤发生发展与预后中扮演重要角色。作为表观遗传学的一种，甲基化可遗传可调控，其关键机制也在近年来的研究中被当作胶质瘤治疗的可能靶点[19,20]。

2.1 DNA甲基化与胶质瘤

CpG岛甲基化表型：CpG岛是DNA甲基化的主要位置，CpG岛甲基化表型（CpG island methylator phenotype, CIMP）指基因组层面CpG岛过甲基化，是包括胶质瘤在内的多种肿瘤的预后指标[21]。研究显示CIMP+的胶质瘤亚型主要出现在低级别胶质瘤样本中，而且这种高甲基化表型的胶质瘤患者具有更好的预后[22,23]。也有研究显示，CIMP含量丰富的胶质瘤随着肿瘤的进展、恶化，其内部的CIMP含量会降低进而表现出CIMP较低的表型[24]。

MGMT 启动子甲基化：在胶质母细胞瘤中，内源性的DNA 甲基化对胶质瘤对化疗药TMZ的反应有重大影响。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）可以修复TMZ等烷基化药物导致的DNA破坏[25]，其启动子区域的甲基化，阻止转录因子于MGMT酶启动子区域的作用，可实现表观遗传学沉默，进而增加胶质母细胞瘤对化疗的敏感性，改善预后[26,27]。有临床研究显示MGMT 启动子甲基化是放化疗后胶质瘤独立预后因素[28]，也可以用于预测 GBM 治疗中替莫唑胺等烷化剂的副作用。

2.2 RNA甲基化与胶质瘤

m6A修饰：m6A甲基化修饰是目前胶质瘤领域RNA修饰研究的热点，而其在胶质瘤发生发展过程中起到的作用尚存争议[29]。有研究表明胶质瘤组织中m6A水平降低，通过过表达关键酶METTL3来增加m6A水平可以有效抑制细胞的增殖与迁移能力并加强细胞的凋亡[30]。但是另有研究表明胶质瘤干细胞在体外分化后，细胞内m6A水平下降，且分化后的细胞内关键甲基转移酶METTL3的表达降低[31]。Wilms肿瘤相关蛋白（WTAP）与METTL3-METTL14复合体共同发挥甲基转移的作用，是m6A甲基化的重要参与蛋白[12]，而有研究表明在恶性胶质瘤组织中WTAP的高表达往往预示着患者更差的预后[32]。胶质瘤中m6A修饰程度及其作用尚未得出定论，m6A在胶质瘤发生发展中不同阶段起到的作用可能截然不同，仍需进一步研究[33]。

2.3 组蛋白甲基化与胶质瘤

组蛋白编码基因突变：编码组蛋白的基因突变，使合成的组蛋白尾端受调控的氨基酸发生改变，进而影响组蛋白相关修饰的读取与写入[34]。组蛋白H3.3突变在肿瘤领域被广泛研究，这类突变引发染色质调控的紊乱，进而影响癌症[14]。H3K27M突变是赖氨酸到甲硫氨酸的突变体，扰乱特定赖氨酸甲基转移酶的靶位点进而影响甲基化，H3K27M与多梳抑制复合体（Polycomb Repressive Complex 2，PRC2）上具有催化作用的亚单元EZH2结合，抑制PRC2促进H3K27甲基化的作用，降低细胞内整体的H3K27甲基化水平[14,35]。此突变是包括弥漫性内源性脑桥胶质瘤（diffuse intrinsic pontine glioma, DIPG）在内的中线小儿高级别胶质瘤特有的突变[36]，对DIPG的研究显示突变与PI3K及TP53等癌症相关通路有关[36]，H3K27M突变的患者相比无此种突变的患者预后更差[38]。WHO也已经将具有H3K27M突变的胶质瘤单独分类[39]。

组蛋白甲基化调节酶：HMTs和HDMTs 都在肿瘤的调节中发挥重要作用，并且都是抗癌治疗的潜在靶点[40]。包括MLL1、PRMT1、EZH2和G9a在内的多种组蛋白甲基化转移酶参与调控胶质瘤细胞中组蛋白赖氨酸的甲基化水平[41]。EZH2在胶质瘤中过表达，与胶质瘤的发展、转移与侵袭均有关[42]，实验研究显示，EZH2调节胶质瘤细胞的凋亡、自噬、细胞周期等相关机制及线粒体膜电位，进而促进肿瘤的发生发展，减少其表达可以有效抑制胶质瘤细胞的增殖与侵袭[43]，临床研究显示EZH2表达较高的胶质瘤患者预后生存更差[42,44]。蛋白质精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferases,PRMTs）是将甲基添加到目标精氨酸残基上的关键酶，有研究表明PRMT1和PRMT5在胶质母细胞瘤细胞和组织中高表达，对患者的生存有负面影响，降低这两个基因的表达可以抑制动物模型上移植瘤的生长[45]。

2.4 基于甲基化机制胶质瘤治疗展望

关于表观遗传学治疗的临床试验已经广为开展，其中一些已经得到批准而在临床实践中试行。基于甲基化相关机制的干预方式也处于探索当中，这些干预方法旨在恢复在这些疾病中观察到的甲基化失衡[46]。

DNMT抑制剂与DNA去甲基化药物，如氮杂胞苷（azacytidine, AZA）、地西他滨（decitabine,DAB），是胞苷类似物，其与DNA结合，竞争DNMT结合位点并促进其降解，抑制DNA甲基化，使平衡向去甲基化移动，进而激活一些抑癌基因的表达[47]。有研究表明，AZA和DAC对患者来源的移植胶质瘤模型有较强的抑制作用，即使后期停止给药，肿瘤也没有再生[47]。PRMT5抑制剂GSK591和LLY-283在体外被证实可以抑制46个患者来源的胶质母细胞瘤干细胞，该研究表明，PRMT5 抑制导致转录组剪接的广泛破坏，特别是抑制细胞周期相关基因产物。LLY-38是具有脑渗透性的PRMT5抑制剂，能显著延长肿瘤原位移植小鼠的存活时间[48]。针对RNA m6A甲基化进行调控的治疗手段也在研发当中，一些含哌嗪环的化合物可以有效地与METTL3-METTL14复合物结合，促进RNA甲基化[49]。有研究显示METTL3的小分子抑制剂可以抑制急性髓系白血病[33]。相信不久之后相关的技术也将应用于胶质瘤的治疗。

3 小结

甲基化在胶质瘤中的作用，随着对其机制的研究越来越深入而逐渐受到重视。目前对甲基化机制的了解，还处于探索阶段，研究已表明，甲基化与胶质瘤的发生发展、临床分类、治疗与预后均有密切的联系，而针对甲基化机制开展的肿瘤治疗方法研究也已处于探索阶段。可以预见，调节甲基化调控中关键的路径将会成为治疗胶质瘤的一种可靠方法。