中药活性成分对肿瘤细胞周期基因的调控作用

申倩，沈雨蕾，曾雪倩，李俊辰，张建岭，庞博

（1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053；2.北京中医药大学，北京 100029；3.上海中医药大学，上海 201203；4.天津中医药大学，天津 301617）

细胞周期分为分裂间期和分裂期（M期），其中分裂间期又可分为DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）[1-3]。G1期是细胞由静止期（G0期）转向细胞增殖周期的起点。S期时细胞内完成染色体DNA复制，形成两条姐妹染色体单体。在G2期，合成有丝分裂所需的RNA和蛋白质等，为M期做准备。M期即有丝分裂期，又可以分为初期、前期、中期、后期和末期，最终分裂形成两个基因相同的子细胞[1-3]。细胞周期是细胞增殖的核心环节，受到多种因素的调控和影响，如Ras-MAPK、PI3K、Wnt和 Notch[4-5]等细胞生长信号途径，受刺激后可引起细胞由静止期（G0期）进入增殖周期。在细胞周期中，细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（Cyclin-Dependent Kinase，CDK）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（Cyclin-dependent kinase inhibitors，CKI） 为生物细胞周期过程中的3类核心调控分子[6]。

Cyclin（CyclinA-T）、CDK（CDK1-9）以及 CKI的两大家族 INK4（p15、p16、p18 和 p19） 和 CIP/KIP（p21、p27和p57）[7]均在细胞周期的不同阶段表达不同的蛋白分子，其进一步在激活和失活中相互转换，从而使得细胞周期顺序进行（图1）。在细胞周期各阶段中，两大家族的成员形成不同的Cyclin-CDK蛋白激酶复合物。Cyclin-CDK蛋白激酶复合物在细胞周期的特定阶段、特定时间点形成和激活，CDK磷酸化特定底物，启动与细胞周期有关基因的转录。这个过程是细胞通过不同的细胞周期阶段尤其是G1/S和G2/M检查点必不可少的，对细胞周期各阶段的完成以及进入下一个阶段起关键和决定性作用，是细胞周期各阶段中最突出的生物学标志性事件[3]。见图1。CKI常与蛋白激酶复合物结合而抑制其活性，从而抑制或阻止细胞周期的进程[8]。目前研究显示，几乎所有的人类肿瘤细胞均存在Cyclin、CDK和CKI基因的突变、扩增和/或表达的异常，在调控细胞周期检查点中起重要作用的p53和pRb信号途径也存在50%以上基因结构的异常[9]。这些结构的异常使得细胞周期和细胞凋亡的调控解除或检查点失能，进一步使携带缺陷基因的细胞因不能被及时阻滞和凋亡，造成持续的细胞周期循环和损伤基因富集，最终使得细胞转化为肿瘤细胞，并无限增殖[10-12]。从某种程度上来说，细胞周期基因的调控在开启或关闭肿瘤细胞生死的过程中起至关重要的作用[13]。因此，针对细胞周期基因分子靶点的调控是目前抗癌药物研究的热点。本文就近年来国内外关于直接调控细胞周期基因分子表达而影响肿瘤细胞周期，具有抑制肿瘤细胞增殖，甚至杀伤肿瘤细胞的多种中药活性成分的研究进行梳理、综述。

图1 中药活性成分调节癌细胞周期Cyclin、CDK和CKI基因表达，阻滞细胞周期进展

1 DNA合成前期（G1期）

在G1期前期，细胞生长信号持续刺激CyclinD基因[基因家族：CCND1（11q13.3）、CCND2（12q13.32）、CCND3（6q21.1）]，使其大量表达并与 CDK4（CDK4，12q4.1）或 CDK6（CDK6，7q21.2）结合，诱导 CyclinDCDK4/CDK6复合物活化[14]。在G1后期，CyclinE基因[基因家族：CCNE1（19q12）、CCNE2（8q22.1）]开始高表达，与 CDK2（CDK2，12q13.2）结合后，在 S 期初期达到最大值，促进细胞周期通过G1/S检查点由G1 期转入 S 期[3，6，14]。在 G1 期，INK4 家族成员能够抑制CyclinD-CDK4/6复合物，使得细胞周期阻滞于 G1/S 期[5]。

Wang等[15]探究补骨脂素对于人肝癌细胞SMMC7721的作用机制，发现补骨脂素能够调节CyclinD1和CyclinE的表达，使其内质网和细胞质结构异常，导致细胞周期被阻滞于G1期，从而抑制肝癌细胞的增殖。Zhang等[16]的实验研究表明，重楼皂苷通过使CDK2表达下降，p21（Cyclin dependent kinase inhibitor 1A，p21，6q21.3）表达升高来抑制人非小细胞肺癌A549的生长。Li[16]等人通过斑蝥素对人表皮样癌细胞A431及其移植小鼠模型的细胞毒性作用实验发现斑蝥素可显著降低细胞中CyclinE、CDK6和CyclinD的蛋白表达水平，诱导细胞在G0/G1期阻滞，从而降低人表皮样癌细胞A431存活率，诱导细胞凋亡。王斌等[18]的研究发现黄连总生物碱联合运动能够下调原位移植4T1乳腺癌小鼠肿瘤细胞 CDK4、CDK6、cyclinD1、CDK2 和 cyclinE蛋白的表达水平，从而使细胞阻滞于G1/S期。樊帅军等[19]发现，汉黄芩素通过降低CyclinD1、CyclinE、CDK2和CDK4蛋白表达，同时使CIP/KIP家族的激酶抑制因子p21和p27蛋白表达升高将结肠癌细胞LoVo阻滞于G0/G1期。钟伟枫等[20]的实验结果显示，龙葵素能抑制裸鼠前列腺癌细胞Du145移植瘤细胞 CyclinD1、CyclinE1、CDK2、CDK4 和 CDK6 的表达，促进p21的表达，从而调控细胞周期G1/S关卡抑制前列腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长。侯新[21]等人的研究表明，苦豆碱能够通过降低CyclinD1的表达，进而抑制宫颈癌细胞Hela的增殖。

G1期形成的Cyclin-CDK复合物能催化G1/S细胞周期进展的主要抑制性蛋白Rb磷酸化，使其与调节细胞周期进展和细胞增殖的重要转录因子E2F解离，从而阻断其抑制E2F的活性，使细胞进入S期[24]。Rb-E2F是遏制外源性信号的“限制点”，因此，抑制G1期癌基因CyclinD、CyclinE、CDK4和CDK6的表达或增加抑癌基因p53（野生型）、p16、p18、p21和p27等表达可使癌细胞被阻滞于G1期，达到抑制细胞增殖，甚至诱导细胞凋亡的作用[5]，见图1。

在探究柴胡皂苷-D抑制宫颈癌细胞Hela的分子机制时，刘志华等[22]的实验发现，柴胡皂苷-D通过降低CyclinD1和CylcinE的表达，增加p53和p21表达，使得宫颈癌细胞Hela阻滞在G1期。Zhu等[23]发现，甘草次酸能够显著抑制CyclinD1、CyclinD3、CyclinE、CDK4、CDK6、CDK2 和 E2F-1 表达，并能上调非小细胞肺癌细胞A549和NCI-H460p16（Cyclindependent kinase inhibitor 2A，p16，9q21.3）、p18（Cyclindependent kinase inhibitor 2C，p18，1p32.3）、p21 和p27（Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B，p27，12p13.1）的表达。由于P16、p18、p21和p27均可竞争结合CDK4/6，使Rb磷酸化被抑制，因此甘草次酸能够通过Rb/E2F通路发挥抑制作用，导致细胞的生长抑制。

中药活性成分，重楼皂苷、斑蝥素、汉黄芩素、龙葵素、甘草次酸等对G1期相关基因具有调控作用，具有进一步研究和开发价值。

2 DNA合成期（S期）

S期最主要的Cyclin/CDK复合物是CyclinA/CDK2[CyclinA 基因家族：CCNA1（13q3.3），CCNA2（4q27）]，它能启动DNA复制，产生两条完全相同的姐妹染色体。从此期开始与外生长信号脱离，仅调节细胞周期内的调节基因的表达才可影响细胞周期的进展[2-7]。中药活性成分，甘草查尔酮B、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、补骨脂酚和淫羊藿苷等对S期基因具有调节作用。

实验研究发现，甘草查尔酮B能够通过降低S期cyclinA、CDK1及CDK2的mRNA表达诱导膀胱癌肿瘤细胞阻滞于S期[25]。周少荷[26]的研究显示丹参酮Ⅰ通过使肝癌细胞7721中Cycline A1蛋白的表达量增少，p21的表达量增加，进而使Cyclin-CDK复合物不能有效形成，同时，CIP/KIP家族抑制蛋白p21高表达，促使细胞被阻滞在S期。周新强等[27]的实验研究发现丹参酮ⅡA通过使食管癌细胞系Eca-109的S期检查点的正向调控基因Cyclin A和CDK2蛋白表达降低，影响DNA复制，使细胞阻滞在S期。除此之外，简晓顺等[28]还发现丹参酮ⅡA可能通过上调P27抑制CDK2，导致非小细胞肺癌细胞NCI-H520阻滞于S期。张哲楠等[29]研究发现，补骨脂酚可诱导人乳腺癌细胞MCF-7产生活性氧，使p53和p21蛋白表达增加，通过p53/p21途径，使得CDK2和CyclinA2表达减少，进而引起细胞阻滞于S期。有研究发现，淫羊藿苷可通过抑制髓母细胞瘤细胞中细胞周期相关蛋白cyclinA、CDK2、cyclinB1的表达诱导其在S期发生阻滞[30]。见图1。

3 DNA合成后期（G2期）到分裂期（M期）

在 G2 期形成的 CyclinA-CDK1（CDK1，10q21.2）及晚期形成的CyclinB-CDK1[CyclinB基因家族：CCNB1（5q13.2，），CCNB2（15q22.2）]在促进 G2 到M期转化中起着关键的作用[31]。CyclinB-CDK1又被称为成熟促进因子，能够转入细胞核，磷酸化核内底物，进而调控有丝分裂[3-5]。负调节CIP/KIP家族的成员对细胞周期Cyclin-CDK复合物均具有重要的负调节作用[3-7]。因此，G2/M期在肿瘤的发生发展以及治疗方面至关重要[32]。

Zhang等[33]的研究表明九里香碱可导致肺癌细胞A549被阻滞在G2/M期，其机制与药物处理后CyclinD、CyclinE、CDK2、CDK4 和 CDK6 表达降低，而p21和p27表达升高有关。薯蓣皂苷元[34]在诱导肝癌细胞Bel-7721、SMMC-7721和HepG2生长抑制实验中显示，薯蓣皂苷元可引起细胞G2/M期阻滞，机制与上调p21和p27的表达有关。Meiyin Chang 等[35]发现芳樟醇通过引起 p53、p21、p27、p16和p18基因的过表达，从而抑制Cyclin-CDK的活性导致宫颈癌细胞HeLa在G2/M期停滞。Kim等[36]观察紫草素对胃癌细胞AGS的细胞毒性作用，发现紫草素通过调控细胞中的p21基因，将细胞周期阻滞于G2/M期，从而抑制细胞增殖。Liu等[37]用吉玛酮处理人肝癌细胞HepG2和Bel7402，结果显示吉玛酮下调CyclinB1和CKD1的表达，使细胞被阻滞于G2/M期。Liu等[38]将杜荆素化合物1用于黑色素瘤细胞的治疗实验中，发现其通过下调CDK1，CDK6，CyclinE和CyclinA的表达，上调p21的表达，使细胞阻滞于G2/M期。Li等[39]发现大戟甘能够通过增加磷酸化CDK1（Tyr15）蛋白水平而诱导宫颈癌细胞HeLa的细胞周期阻滞于G2/M期。

苦杏仁苷对于多种晚期肿瘤都有很好的抑制作用。Shi等[40]的研究显示苦杏仁苷通过抑制CDK1、CDK2、CDK4、CyclinA和CyclinB的表达使肾癌细胞周期阻滞在G2/M期，它也能通过抑制CDK1、CDK2、CDK4、CyclinA、CyclinB和 CyclinD3的表达，促进p19和p27的表达（抑制CDK活性），使前列腺癌的细胞周期阻滞在G2/M期。罗燕等[41]的研究显示柴胡皂苷 D 可通过降低 CyclinA1、CyclinA2、CyclinB1、CyclinB2的蛋白和mRNA的表达，从而通过减少Cyclin-CDK蛋白激酶形成使乳腺癌细胞MDAMB-231阻滞于G2期。见图1。

这些研究显示，薯蓣皂苷元、芳樟醇、紫草素、苦杏仁苷、柴胡皂苷D等对G2期和M期基因具有调控作用，具有进一步研究和开发价值。

4 结语与展望

目前研究显示：中药活性成分主要通过调控抑制肿瘤细胞周期G1期的CyclinD-CDK4/6和CyclinE-CDK2，S 期 的 CyclinA-CDK2，G2 期 的CyclinA-CDK1以及M期的CyclinB-CDK1表达，升高 INK4家族的 p16、p18、p19和 CIP/KIP家族的p21、p27、p57的表达来阻滞肿瘤细胞的细胞周期。细胞周期受到高度精细调节，与其上游Ras-MAPK、PI3K、Wnt和Notch等多种癌基因信号途径、p53/p21等多种抑癌基因信号途径及其下游E2F等多种靶基因密切联系。这些信号途径的异常与Cyclin、CDK、CDKI家族基因突变、扩增或表达失控都是通过细胞周期而最终发挥“癌生物学”作用的，因此亟待针对细胞周期药物的研究和开发。本文汇总、归纳了中药活性成分对细胞周期Cyclin、CDK、CDKI家族基因及其表达的调控作用。研究显示1种中药活性成分可调节1-7种细胞周期基因（表1），涉及癌基因和抑癌基因的表达，其作用是明确的，但对细胞周期基因表达的精准调节机制以及其更深层次的相互关系还需要进一步梳理和明晰。目前，尚存在的另一个问题是，几乎所有肿瘤都至少存在1项Cyclin、CDK和CKI基因突变或表达异常，但中药活性成分对这些突变基因及异常表达基因的调控作用研究尚少，仍待开展研究和解析。综上分析可以得出，药物靶向作用于肿瘤细胞周期基因是控制肿瘤细胞生死，抑制其无限制增殖的末节核心开关，因此在此领域的中药活性成分（如，斑蝥素、汉黄芩素、紫草素、苦杏仁苷等）药效基因靶点研究是具有巨大潜力的研究领域，需要研究者不断深入探索。