二代测序技术在结核病病原学诊断、耐药性检测及流行病学监测中的应用研究进展

王钰琪，任靖宜，康小文

哈尔滨医科大学附属第二医院呼吸与危重症医学科，哈尔滨150081

结核病是一种历史悠久的慢性传染病，可分为肺结核病和肺外结核病，其致病菌为结核分枝杆菌(MTB)。由于肺结核的非特异性症状和体征通常与常见的肺部感染重叠，因此诊断相对困难，迫切需要快速且无假阳性的诊断方法以准确地区分肺结核与其他常见的肺部感染，减少与结核相关的死亡[1-2]。传统的结核病病因学诊断有痰涂片及MTB培养检测法。痰涂片是一种广泛用于检测抗酸分枝杆菌以诊断结核病的方法，然而这种方法灵敏度低,不能将MTB与其他抗酸杆菌区分开来；MTB培养检测法是传统的结核病诊断金标准，其敏感度较高，但周转时间长、通量低、实验室生物安全要求苛刻，不能快速诊断结核病。这些传统方法虽然可以识别活动性结核病，但对潜伏性结核病的检测并不令人满意。与传统的培养方法相比，分子生物学技术可以促进结核病的诊断。分子检测方法通常被称为核酸扩增实验，依赖于MTB复合体的靶向遗传区域的扩增，通常通过PCR技术实现。Xpert是一种快速分子检测手段，用于检测MTB复合体的DNA及与耐药性相关的基因突变，于2010年被世界卫生组织推荐对有结核病症状和体征的患者做初步诊断并被用于耐药性监测。相比于传统的涂片及培养检查，Xpert敏感度更高、检测时间更短、用于检测的标本更多样，并可以检测是否为耐药结核病[3]。但Xpert对肺外标本的MTB检测灵敏度有限，并且在不同类型的标本中存在很大差异[4]。近年来二代测序技术(NGS)的快速发展使其在多种传染病中被用于疾病诊断、病原体鉴定、耐药性测定和疫情调查，综合数据来看其精确度较高[5]。基于NGS发展的感染性疾病病原体检测技术主要包括宏基因组测序(mNGS)、全基因组测序(WGS)以及扩增子测序(以16 S rRNA和ITS测序为代表)等。本文就NGS在结核病病原学诊断、耐药性检测及流行病学监测中的应用研究进展做一综述。

1 NGS在结核病病原学诊断中的应用

2017年，英格兰率先将NGS用于结核病诊断、耐药性检测和MTB分型。相较于传统检测方法，NGS具有周期短、无偏倚、灵敏度高、覆盖率高的特点，因而对病原体，尤其是少见病原体的诊断有重要意义。其可避免传统诊断时各种病原体之间互相影响从而影响诊断结果的准确性，并且可以将标本中存在的核酸全部检测出来，提高了检测效率。在混合感染中，NGS可以快速准确地识别标本中的所有病原体，指导临床诊断治疗。

mNGS是一种无偏性测序方法，理论上可以检测出临床样本中的所有病原体，尤其适用于复杂感染性疾病的罕见和非典型病因[6]。mNGS作为一种检测感染性疾病病原体的新方法已被广泛应用，但其在结核快速诊断中的价值尚未得到大样本验证。ZHOU等[7]对105例疑似活动性结核病感染患者的痰液、脑脊液、脓液等样本进行了同步结核培养、Xpert和mNGS检测，根据临床最终诊断结果得出结论，mNGS敏感度为44%，略高于Xpert的42%，但远高于传统方法(29%)。该研究还发现，结合Xpert和mNGS两种诊断方法，预测活动性结核病的敏感度可上升至60%。CHEN等[8]研究发现，mNGS在临床疑为结核感染的患者中显示出比传统培养和Xpert检测更好的诊断性能,尤其是在肺标本中，其预测结核感染的敏感度优于传统培养和Xpert。在肺外结核的诊断方面，mNGS也体现出了其特有的优势。结核性脑膜炎(TBM)是常见的中枢神经系统结核病，也是最致命的结核病感染形式，及时诊断及治疗可显著降低其病死率。YAN等[9]对脑脊液标本进行了mNGS和传统检测方法的TBM检测，发现mNGS敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为84.44%、100%、100%、46.15%，mNGS诊断TBM的敏感度高于AFB(抗酸杆菌)涂片、培养法、MTB PCR法及Xpert。

研究显示，将mNGS与Xpert或培养法结合在鉴定MTB感染中显示出突出的优势。SHI等[10]对116名怀疑有活动性结核感染的患者进行了支气管镜检查及临床灌洗液或其他组织标本的Xpert和mNGS检测，发现在结核病诊断性能方面，mNGS对所有活动性结核病病例的灌洗液样品显示出47.92%的敏感度，与Xpert(45.83%)和培养法(46.81%)相似，但远高于传统的抗酸染色检查(29.17%)。而将mNGS和Xpert联合应用于对灌洗液样品的检测，其诊断MTB的敏感度为56.25%，这表明mNGS和Xpert相结合有助于提高MTB临床诊断的准确度。WANG等[11]回顾了23例来对脑脊液样本进行mNGS和传统病因学检查的TBM病例，试图说明mNGS在TBM早期诊断中的可行性，并评估所有方法之间的敏感度和特异度。结果显示，mNGS在18例病例中鉴定出了映射到MTB复合体的DNA序列，包括MTB、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌和稻曲霉。在所有方法中，mNGS的灵敏度最高，而mNGS和传统培养法的组合可提高检测率。

抗生素治疗是降低病原体检测阳性率的常见原因，传统的培养或涂片检查方法取决于标本中是否存在活菌，而抗生素对活菌具有一定的杀灭作用，可能导致传统检测方法检出率下降。mNGS是基于病原体DNA检测的分子方法，因此对病原学的检测受治疗影响较小。研究表明，抗生素治疗后的肺外结核患者和抗生素治疗前的肺外结核患者之间的mNGS检测率没有明显差异，验证了该观点[4]。

2 NGS在结核病耐药性检测中的应用

耐药性的出现对全球结核病控制工作构成了挑战，严重阻碍了疾病的治愈。目前，治疗结核病的一线药物包括利福平(RIF)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)和吡嗪酰胺(PYZ)。耐药结核病可分为单耐药(INH或RIF)、耐多药(INH和RIF)、广泛耐药(INH、RIF、氟喹诺酮类和注射用氨基糖苷类)结核病。相关数据显示，耐多药结核病和广泛耐药结核病的治疗成功率分别为54%和30%，而耐药结核病的治疗总成功率为83%。全面、及时的药敏检测对于指导耐药结核病的治疗至关重要，因此，需要改进检测工具来指导患者的治疗选择。传统的表型检测无法区分MTB和其他分支杆菌，灵敏度为30%～60%，不足以满足临床需求。世界卫生组织推荐了许多用于诊断耐多药和广泛耐药结核病的基因型检测，包括核酸扩增检测和Xpert等。然而，这些检测只能针对少数基因的重点区域来检测，可检测的耐药药物数量也有限，并不能报告耐药性所依据的确切核苷酸变化，而NGS的数据可以筛选所有的耐药决定因素，具有更高的敏感度。大量研究表明，NGS在分枝杆菌鉴定和耐药性测试方面可能比传统方法更快、更具成本效益[12]。一项前瞻性研究对777个MTB分离株进行了分析并将WGS对4种一线药物的表型敏感度进行了测试，发现WGS对INH、RIF、EMB和PYZ耐药性预测的敏感度分别为93.1%、100%、100%和81.8%[13]。SHEA等[14]研究显示，WGS对RIF、卡那霉素和氟喹诺酮类药物的表型耐药敏感度为100%，对INH、EMB、PYZ、链霉素和乙硫酰胺的敏感度分别为87%、79%、86%、73%和62%，并且预测以上药物耐药性的特异度超过97%。靶向下一代测序(tNGS)可从患者痰液样本中对MTB进行药物敏感度测试，能够更全面地分析基因组耐药相关变异，可用于临床诊断耐药结核病。HE等[15]研究表明，tNGS诊断结核病耐药性的总体阳性率为83.3%，高于抗酸杆菌涂片、培养法、TB-DNA扩增检测、TB-RNA扩增检测、MGIT 960快速培养药敏，甚至T细胞斑点检测。此外，有研究发现，使用NGS进行基因型耐药性预测具有良好的性能，特别是对最重要的一线药物INH和RIF，INH灵敏度和特异度分别为97.5%和99.6%，RIF为100%和99.2%[16]。PAPAVENTSIS等[17]对NGS检测MTB耐药性进行了系统评价，发现其灵敏度及特异度均较高，与上述结论相符。

3 NGS在结核病流行病学监测中的应用

WGS的优势在于发现和开发新的标志物以进行流行病学监测或临床诊断，在结核病中，其比传统流行病学监测方法具有更高的分辨率。有研究对乌兹别克斯坦的两种MTB菌株进行流行病学分析发现，在传统流行病学标记法的检测下，两种菌株几乎完全相同；而WGS数据显示，菌株之间具有数十个单核苷酸多态性(SNP)差异，这提示应用WGS可以提供比其他分子标记更高的分辨率[18]。WGS的另一个重要应用是能够检测同一患者中由于合并感染或由于同一菌株感染而引起的原发性结核复发的频率，该作用在公共卫生干预以及检测爆发和传播事件中的实用性已得到证实。从全球角度来看，WGS能够以前所未有的分辨率检测MTB中的遗传多样性。WGS可以识别不同菌株之间的SNP，这在尝试区分再感染引起的临床复发时起到关键作用。WITNEY等[19]使用24位点MIRU-VNTR基因多拷贝数快速检测分析法、间隔区寡核苷酸分型法和WGS对36名治疗前后培养阳性的MTB患者的菌株进行了分型，发现WGS识别出一对具有中等数量SNP差异(大于5)并将此归类为复发，而另外两种检测方法无法做到这一点，提示WGS可以更准确地评估初次合并感染、复发或再感染的病例。WALKER等[20]发表了基于WGS的大规模结核病传播研究，该研究显示，WGS相比于以往的菌株分型方法可以更准确地识别属于暴发的病例，从而证实了WGS在流行病学监测中应用的优越性。

综上所述，NGS作为一种新型检测方法，在结核病的病原学诊断、耐药性检测及流行病学监测中发挥出较大价值。mNGS可以检测出临床样本中的所有病原体，在对MTB的病原体诊断与鉴别诊断方面具有一定的优势；WGS及tNGS可以筛选更多的耐药基因，在结核病的耐药性检测方面具有更高的敏感度；且WGS可以提供比以前的分子标记更高的分辨率，正在成为结核病分子流行病学监测的新金标准。临床上将NGS与培养或Xpert相结合可提高结核病的诊断效率，并为耐药菌株的检测及药物的选择提供依据。但NGS在结核病快速诊断中的价值尚未得到大样本验证，缺乏统一的指控标准及流程，临床解读NGS报告的指南仍需完善。在临床应用中，NGS仍然需要提高检测可靠性、解决背景菌干扰问题、降低检测成本。未来NGS有望成为病原学诊断及治疗的关键技术,从而帮助临床医生做出更明智的治疗相关决策。