RhoA/ROCK信号通路对免疫细胞的调控及其在心肌损伤中的潜在作用研究进展

张好东，王文娟，裴瑛，寇城坤，王琼英，余静

兰州大学第二医院高血压中心，兰州730000

心血管疾病已成为全球发病率最高的疾病之一，是威胁人类健康的一大杀手。心脏内的免疫细胞在心肌损伤后迅速激活，引发针对心脏的持续性自身免疫反应[1]。Ras同源家族成员A(RhoA)属于RhoGTP亚家族蛋白，其能够激活下游的ROCK激酶，进而影响细胞分子的生成与分泌，并产生相应的生物学效应，这一系列反应构成RhoA/ROCK信号通路。研究发现，RhoA依赖性信号传导对于免疫细胞的激活至关重要，并且在心肌细胞的信号转导和受体激活中发挥重要作用[2]。因此，对RhoA/ROCK信号通路与免疫细胞之间的作用机制进行深入了解，对于心脏疾病的治疗尤为重要。本文就RhoA/ROCK信号通路通过调节免疫应答在心肌损伤中的潜在意义综述如下。

1 RhoA/ROCK信号通路的生物学结构及作用

1.1 生物学结构 RhoGTP酶是小分子鸟苷酸三磷酸酶Ras超家族的成员之一，目前已被发现的20多种RhoGTP酶中，RhoA、RhoB、RhoC、Rac1、Rac2、Rac3、Cdc42等较为经典。RhoA是Rho蛋白家族中目前为止研究最为透彻的成员,其本质为单体G蛋白，结构序列相对保守,可活化多种上游刺激信号,包括血小板源性生长因子(PDGF)、血管紧张素Ⅱ以及内皮素等。ROCK又称Rho激酶，是分子质量为160 kDa的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶,与Rho蛋白共同参与调节平滑肌细胞的黏附、迁移、增殖和分化[3]。ROCK家族分为ROCK1(具有1 354个氨基酸，位于18号染色体上)和ROCK2(具有1 388个氨基酸，位于2号染色体上)两个亚型，其氨基酸序列是由氨基端激酶催化结构域(RBD)结合Rho结构域的螺旋区域以及富含半胱氨酸的羧基端PH结构域形成的环状结构共同组成。研究显示，这二种亚型的氨基酸序列约有65%的同源性，ROCK1和ROCK2在全身组织中广泛表达，ROCK1的表达在肝、肺、肾、脾和睾丸中居多,而ROCK2则在脑、心脏和肌肉中居多[4]。

1.2 生物学作用 Rho蛋白家族主要受GTP酶激活蛋白(GAP)和鸟苷酸交换因子(GEF)共同参与调节，表现为当信号激活时，GEFs分子催化核苷酸，使RhoGTP酶由结合GDP状态转换为结合GTP状态，导致RhoGTP酶激活。相反，GAPs刺激GTP水解，导致RhoGTP酶失活。因此，RhoA可通过在活性GTP结合状态/非活性GDP结合状态之间相互转换，充当“分子开关”的作用，从而在心肌细胞表面靶蛋白或细胞骨架中发挥生物学效应[5]。

RhoA/ROCK信号通路中，RhoA与GTP结合激活下游ROCK,并进一步磷酸化ROCK下游底物。目前发现ROCK最主要的作用底物有肌球蛋白轻链(MLC)、肌球蛋白磷酸酶(MLCP)的肌球蛋白结合亚单位(MYPT1)，ROCK与MLC结合可直接使MLC磷酸化并抑制MLCP活性，大量MLC磷酸化激动肌球蛋白，从而调控细胞骨架[6]。

此外，RhoA/ROCK信号通路在心血管系统中还具有如下生理特点：①减少血管内皮细胞分泌一氧化氮，使血管平滑肌对Ca2+的敏感性增加，诱发血管平滑肌细胞收缩[7]；②促进巨噬细胞分化，加速动脉粥样硬化的进展[8]；③既可启动炎症反应又可促进炎症反应，导致炎症因子大量聚集，加重心肌缺血损伤[9]。

2 RhoA/ROCK信号通路在免疫细胞中的作用

免疫系统根据其免疫识别的机制和受体不同可分为先天免疫系统和适应性免疫系统。先天免疫系统通过模式识别受体激活，包括炎症细胞因子的释放和先天免疫细胞如巨噬细胞、树突状细胞及粒细胞进入机体组织而发挥生物学作用。适应性免疫系统与先天性免疫系统相反，它通过获得病原体特异性受体来建立“免疫记忆”，还具有体液和细胞成分，可以与先天免疫系统相互作用[10]。RhoA是一种普遍表达的小GTP酶，不仅在重塑细胞骨架中充当分子开关，还可响应从先天性和适应性免疫细胞释放的趋化因子、细胞因子和生长因子而被激活，在免疫反应中发挥重要作用。

2.1 先天性免疫细胞 先天性免疫细胞主要分为巨噬细胞、树突细胞及粒细胞。巨噬细胞通过清除凋亡细胞以维持组织稳态，存在于不同组织中的巨噬细胞根据其所处环境的变化形成不同的巨噬细胞亚型，如M1巨噬细胞和M2巨噬细胞。M1巨噬细胞主要参与促炎反应，产生促炎相关因子如白细胞介素(IL)6、IL-12和肿瘤坏死因子(TNF)；而M2巨噬细胞主要参与抗炎反应。在机体感染时，巨噬细胞首先极化为促炎M1表型，以协助宿主对抗病原体；随后，巨噬细胞极化形成对M2表型的抗炎反应并修复组织损伤[11]。

研究显示，巨噬细胞迁移需要RhoGTP酶的活性，RhoGTP酶是肌动蛋白细胞骨架组织和细胞运动的重要调节因子，其中Cdc42、Rac1、RhoA和RhoB的研究最为深入。游走巨噬细胞具有极性，可出现头部和尾部，头部又可出现丝状伪足和板状伪足，从而引导巨噬细胞的定向游走。RhoA的缺失可抑制巨噬细胞尾部回缩，但增加了其迁移速度。此外，当表面整合素表达减少时，RhoB的缺失会损害原代小鼠骨髓巨噬细胞(BMM)的黏附并抑制其迁移。RhoA和RhoB共同缺失时会显著改变静息BMM的形态使其变为星状形态，在趋化迁移过程中，共同缺失的细胞以比单个缺失细胞更快的速度移动[12]。与RhoA、RhoB同为RhoGTP酶的Rac和Cdc42也是巨噬细胞迁移的重要参与者，局部Cdc42信号传导与趋化迁移过程中的导向细胞有关，而Rac对伪足形成来说必不可少[13-14]。

未成熟树突细胞的迁移取决于两个主要的肌动蛋白池，即位于细胞后部的后部的RhoA-mDia1依赖性肌动蛋白池(有助于树突细胞向前迁移)及位于前端的Cdc42-Arp2/3依赖的肌动蛋白池(促进抗原捕获但限制了迁移)。在树突细胞成熟过程中，细胞前沿的Cdc42-Arp2/3依赖性肌动蛋白显著减少，成熟后的树突细胞主要通过RhoA-mDia1依赖性运动模式进行趋化迁移[15]。鼠树突细胞中MYO9B基因的缺乏可导致RhoA信号传导活性升高以及Rho靶蛋白cofilin失活，提示MYO9B可能成为树突细胞中Rho/RhoA效应器Rho激酶/LIM域激酶信号通路的负关键调节因子，以诱导适应性免疫应答[16]。

粒细胞迁移也需要Rac和RhoA的参与。Rac1可调节尾足类动物中的中性粒细胞Rho活性，从而调节肌球蛋白Ⅱ介导的粒细胞收缩性。研究发现，Rac1和Rac2双缺陷小鼠获得的粒细胞特征可表现为RhoA的活性减弱[17]。此外，Cdc42和RhoA均可调节磷酸酶和张力蛋白同源物的时空活性，从而调节细胞迁移的方向[18]。由上可见，RhoA/ROCK信号通路对于先天性免疫细胞的激活和迁移至关重要。一般来说，后端的RhoA上调和免疫细胞前缘的RhoA抑制有助于细胞定向迁移。因此，在空间和时间层面上严格控制RhoA/ROCK信号通路可调控免疫系统，以发挥有效的免疫应答。

2.2 适应性免疫细胞 适应性免疫细胞一般包括T淋巴细胞及B淋巴细胞，这些免疫细胞中RhoA的表达同样受空间和时间方式的高度控制。RhoA的激活与T淋巴细胞受体(TCR)相关,TCR可以识别其他细胞表面的主要组织相容性复合体及抗原复合物，进而诱导下游的多种信号通路，增强其他免疫细胞的协同刺激和促炎作用[19]。T淋巴细胞通过组织细胞外基质进行迁移，需要激活胶原蛋白受体盘状结构域受体1(DDR1)诱导的RhoA/ROCK/ERK信号通路从而发挥生物学效应[20]。研究发现，RhoA缺乏会抑制辅助性T淋巴细胞(Th)2和Th17细胞分化，但对Th1、诱导调节性T淋巴细胞(iTreg)和天然调节性T淋巴细胞(nTreg)分化没有影响。而Cdc42可抑制Th1和Th17细胞的分化，但促进Th2和iTreg细胞的分化以及nTreg细胞的稳定性[21]。

RhoA也是B淋巴细胞活化的重要调节剂，其能够以高亲和力结合蛋白抗原来触发B淋巴细胞受体(BCR)从而激活BCR相关的脾酪氨酸激酶，后者能够通过B淋巴细胞接头蛋白反过来激活在转化生长因子β受体及表皮生长因子受体的下游发挥重要作用的Vav2，具体表现为一方面刺激Rac和Cdc42，另一方面激活RhoA[22]。此外，活性RhoA可通过对肌动蛋白切断蛋白cofilin的影响来限制BCR的迁移，从而干扰TOLL样受体配体，增强BCR信号传导的能力[23]。由上可见，RhoA/ROCK信号通路的激活可以影响适应性免疫细胞的迁移和刺激能力。

3 RhoA/ROCK信号通路调节免疫应答在心肌损伤中的作用

心肌细胞损伤时，会释放带有危险相关分子模式的危险信号，这些信号被模式识别受体识别，并由特定的免疫细胞和心肌细胞表达。在受损的心肌组织中，M1巨噬细胞具有清除坏死组织的能力，当吞噬凋亡细胞时，巨噬细胞释放抗炎细胞因子，促进巨噬细胞群向修复表型转变，这有助于抑制炎症损伤并改善心脏重塑。M2巨噬细胞则可抑制CD4+T淋巴细胞和粒细胞活性，从而改善心功能。有学者使用心肌球源性细胞进行研究，发现浸润的巨噬细胞可以在缺血心脏中获得心肌保护表型，并通过激活心肌细胞中的抗凋亡程序来减轻心肌损伤的程度[24]。T淋巴细胞在改善心肌损伤中也发挥着重要作用，研究显示，调节性T淋巴细胞可以减少受损心脏中促炎细胞的浸润并防止心力衰竭的发生。多项研究表明，RhoA依赖性信号传导对于有效的免疫细胞激活以及心肌细胞中危险信号的转导发挥着重要作用。RhoA信号通路可参与巨噬细胞的极化，介导树突细胞和T淋巴细胞之间的相互作用，促进促炎和抗炎表型的重塑，进而参与心脏功能障碍的的发生发展。LIU等[25]研究发现，RhoA的缺失会下调巨噬细胞中CX3CR1/CX3CL1信号传导，抑制巨噬细胞浸润，阻止血管闭塞，消除小鼠心脏同种异体移植物的慢性排斥。因此，RhoA/ROCK信号通路的激活可以调节免疫反应以发挥保护心肌损伤的作用。

综上所述，心肌损伤的发生发展及转归需要心肌细胞及先天性、适应性免疫细胞的共同参与，其中涉及细胞内多种信号的传导，RhoA是关键介质之一。RhoA/ROCK信号通路在免疫系统中的激活及RhoA依赖性下游信号的传导在心肌细胞和免疫细胞中均起着重要作用，然而其具体机制尚不明确。此外，Rho/ROCK信号通路在不同组织细胞中的不同作用、Rho/ROCK信号通路抑制剂及其针对靶点不同而导致的不同生理功能影响等都需要进一步阐明。随着对RhoA/ROCK信号通路的深入研究，相信其未来一定能为心肌损伤的临床诊疗提供新的高效途径。