外泌体调控Notch 信号通路活化机制的研究进展

葛鑫宇，唐昊

中国人民解放军海军军医大学第一附属医院创伤骨科，上海200433

外泌体是一种由细胞内释放到细胞外微环境的膜性囊泡，几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体。外泌体能够携带蛋白质、脂质、核酸等生物活性物质，可作为信息传递的载体，参与细胞间信息传递，从而参与人体多种生理和病理过程。外泌体的功能主要取决于其蛋白质和核酸的组成。有研究表明，外泌体通过活化多种信号通路，如Hedgehog、Wnt、Notch 等信号通路，从而参与细胞增殖与分化、组织损伤修复、免疫细胞活性调节、病毒感染后应答等生物学过程［1-2］。Notch 信号通路是一个在进化过程中高度保守的信号通路，主要由Notch 受体、配体以及负责胞内信号传导的效应器分子三部分组成。Notch信号通路在细胞增殖、分化以及恶性转化等过程中具有关键性作用［3］。外泌体可通过调控Nocth信号通路的受体、配体以及细胞内效应器分子，参与多种细胞的生物学过程［4］。本文结合文献就外泌体调控Notch 信号通路活化机制的研究进展作一综述。

1 Notch信号通路概述

1.1 Notch 信号通路组成 Notch 信号通路是一个在进化过程中高度保守的信号通路，在脊椎动物和非脊椎动物中普遍存在。Notch 基因最早于1917 年由MORGAN 及其同事在突变的果蝇中发现，该基因负责编码跨膜受体蛋白家族。Notch 信号通路是由Notch 受体、Notch 配体以及负责胞内信号传导的效应器分子三部分组成。哺乳动物的Notch 受体有4种，分别为Notch1、Notch2、Notch3 和Notch4，定位于细胞膜上，可与Notch 配体结合。Notch 配体有5种，分别为Delta-like1（Dll1）、Delta-like3（Dll3）、Deltalike4（Dll4）、Jagged1 和Jagged2，能够与细胞膜表面的Notch 受体结合。胞内效应器分子以CSL 最为重要。CSL 与Notch 受体的胞内段（NICD）结合可激活靶基因的转录，而CSL控制靶基因转录的关键环节。此外，Numb、Deltex1、Deltex2、Deltex3 等调节因子亦可作为效应器分子，参与调控Notch信号传递。

Notch 信号通路活化有两条途径：经典的Notch信号传导途径和非经典的CSL非依赖途径。经典的Notch 信号传导途径又称CBF-1/RBP-Jκ 依赖途径，在信号通路活化过程中，细胞膜上的Notch 受体与来自细胞外的Notch 配体结合，在各种酶的裂解作用下，NICD 释放入胞内并进入细胞核，与CSL 蛋白、MAML结合形成转录激活物NICD-CSL-MAML，该转录激活物与位于基因增强子元件中的Notch 调控元件结合，导致Notch 的靶基因Hes、Hey 表达，而Hes、Hey 等bHLH 家族转录因子能够促进其下游基因的表达［4］。CSL 非依赖途径与经典的Notch 信号传导途径不同，Notch 受体不是在与Notch 配体结合后被激活，而是在与E3 泛素连接酶Deltex 结合后被激活。Notch 受体被Deltex 激活后，通过内吞作用进入细胞内。Notch 受体在细胞内的多泡体中进行S3 裂解，NICD 释放至细胞质并进入细胞核，与CSL蛋白、MAML 结合形成转录激活物，之后的激活过程与经典的Notch信号传导途径相同［5］。

1.2 Notch 信号通路的生物学功能 Notch 信号通路能够参与细胞增殖、分化以及上皮间质转化等生物学过程，而这些生物学过程是肿瘤发生的关键环节。因此，Notch信号通路在肿瘤发生过程中扮演重要角色。在细胞癌变过程中，Notch信号通路组成的调控网络能够以Notch1、Notch2、Notch3受体和Jagged1配体为靶点，参与调控肿瘤干细胞（CSCs）功能［6］。如在胶质母细胞瘤中，Notch1 受体能够介导非肿瘤细胞去分化为肿瘤干细胞，从而增强肿瘤细胞的增殖和迁移能力［7］。在肿瘤发生过程中，由于Notch 信号通路异常表达，增殖能力较低的正常细胞去分化变为增殖能力较强的肿瘤细胞。但白血病是一种较为特殊的肿瘤，其肿瘤细胞是由增殖能力较强的造血干细胞异常分化而来。各型白血病的发生亦与Notch 信号通路有着密切联系。在急性T 淋巴细胞白血病中，Notch1 受体异常活化具有关键性调节作用，能够促进异常T 淋巴细胞增殖。而在急性B 淋巴细胞白血病中，Notch3、Notch4 受体和Jagged1、Jagged2、Dll1 配体均存在异常活化。在急性髓细胞白血病中，Notch2 受体异常活化能够导致造血干细胞异常活化。外泌体能够通过Notch 信号通路调控造血干细胞异常分化。因此，Notch信号通路异常会抑制正常造血干细胞产生，导致白血病发生［8］。

在免疫系统炎症反应中，巨噬细胞发挥重要作用，而Notch 信号通路则是控制巨噬细胞生物学功能的关键调节器。Notch 信号通路激活后能够使巨噬细胞向M1 型分化，从而释放细胞因子和趋化因子，加重炎症反应［9］。在感染性疾病中，被病原体感染细胞的Notch 信号通路调控因子表达增加，感染细胞释放的外泌体进入细胞外液，通过多种方式作用于巨噬细胞，使巨噬细胞的Notch1、Notch2、Notch3 受体以及Dll1、Dll4 配体表达增加，从而促进巨噬细胞向M1型分化，继而增强炎症反应。

除了参与炎症反应外，Notch信号通路还能参与心脏发育。Notch 信号通路异常可导致先天性心脏病发生。在心脏和主动脉发育过程中，Notch3 受体和Jagged1配体激活可促进血管平滑肌形成，为主动脉壁的正常发育提供了条件；Notch1 受体可参与主动脉瓣形成，故Notch1 受体缺失会导致主动脉瓣疾病；Notch2、Notch4 受体与右心室流出道形成有关，Notch2、Notch4 受体异常会导致法洛四联症发生［10］。因此，通过干预Notch 信号通路促进心肌细胞修复是一种可行的方法。除了调控大血管生成外，Notch信号通路还能调控中小血管和微血管生成。肿瘤血管生成、损伤后新生血管生成以及血管分支调控均由Notch 信号通路控制［11］。血管生成主要受血管内皮生长因子（VEGF）调控，血管内皮细胞在VEGF、Notch 信号通路作用下激活并发生增殖和迁移。VEGF 能够促进血管内皮细胞中Dll4配体表达，Dll4配体可作用于相邻的内皮细胞，导致VEGF 受体表达下调，形成负反馈机制，防止血管过度增殖。因此，Notch信号通路可通过直接或间接作用调控血管生成［12］。

此外，Notch信号通路还能参与皮肤生成与损伤修复。Notch1、Notch2 受体在表皮中均有表达。在皮肤中Notch 信号通路被激活后，Notch1 受体表达增强，促使表皮细胞增殖和分化能力增强。此外，Notch 信号通路还能调控皮肤成纤维细胞增殖和分化，在皮肤伤口愈合以及皮肤病发病过程中发挥重要作用［3］。

2 外泌体调控Notch信号通路活化的机制

2.1 外泌体对Notch 受体的调控 外泌体调控靶细胞的Notch 受体时，外泌体自身携带的信号分子可直接作用于靶细胞。外泌体对Notch 受体的调控方式主要有两种。第一种方式为外泌体直接作用于靶细胞膜上的Notch 受体，通过影响Notch 受体激活调控靶细胞的生物学功能。如CD8+T 细胞外泌体中NADPH 氧化酶2减少，对临近细胞的Notch4受体抑制作用降低，可促进血管内皮细胞RAB5A、RAB11A 表达并抑制RAB7A 表达，从而引起巨细胞动脉炎。因此，抑制Notch4 受体可纠正免疫缺陷并保护动脉免受炎症损伤［13］。第二种方式为外泌体中的miRNA、lncRNA、蛋白等分子作用于靶细胞，从而调控靶细胞Notch 受体的转录与合成，这种信号传导方式具有信号级联放大效应，因信号传导效率较高，易于检测，是目前研究较多的调控方式。

外泌体调控Notch 信号通路时，通常是外泌体中的蛋白作用于靶细胞，从而调控靶细胞的功能。如天冬氨酸β 羟化酶（ASPH）在正常组织中沉默表达，仅在肿瘤组织中表达，其功能是产生和维持肿瘤的恶性表型。乳腺癌细胞的外泌体中含有ASPH，而ASPH 可作用于临近的肿瘤细胞和间质细胞，直接影响Notch1 受体与Jagged1 配体结合，同时影响ADAM10 和ADAM17 结 合，随 后 激 活Notch 信 号 通路，使致癌外泌体的合成与分泌增加，从而促进肿瘤转移［14］。在促进肿瘤转移的蛋白中，CD44v6的作用与ASPH 相似。有研究报道，胰腺癌细胞的外泌体中含有CD44v6，CD44v6 通过促进Notch1 受体转录，激活Notch 信号通路，增加致癌外泌体的合成与分泌。因此，CD44v6 亦具有促进肿瘤转移的作用［15］。另外，乳腺癌基质细胞的外泌体可通过负责信号转导与转录激活的STAT1作用于乳腺癌细胞的Notch3受体，能够增强肿瘤细胞的化疗抵抗，间接促进肿瘤细胞的增殖能力［16］。外泌体中的蛋白在信号调控中具有关键作用，因而干预外泌体中蛋白的表达亦可影响靶细胞Notch 受体的表达。有研究发现，使用二十二碳六烯酸干预血管平滑肌细胞后，血管平滑肌细胞的外泌体中MMP-2、MMP-9 活性显著降低，导致血管内皮细胞Notch3 受体表达增加，从而使血管内皮细胞的增殖和分化能力增强。相反，当主动脉内皮细胞受到TGF-β1刺激时，主动脉内皮细胞外泌体中的血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）信号减少，VEGFR2 信号减少使得血管内皮细胞中Notch1 受体表达下调，从而使血管内皮细胞增殖和分化能力降低［17］。

外泌体中的各种RNA 亦可作为信号分子影响靶细胞的功能。lncRNA 虽然不能编码蛋白质，但在表观遗传、细胞周期和细胞分化等生物学过程中具有重要作用。如高分化膀胱癌细胞外泌体中的LINC00960、LINC02470可通过上调低分化膀胱癌细胞中的Notch1、Notch4受体表达，并诱导上皮间质转化，使膀胱癌的恶性程度增加［18］。影响靶基因mRNA 转录的miRNA 同样可通过外泌体作用于靶细胞，调控Notch 受体的转录。如横纹肌肉瘤细胞外泌体中的miRNA，通过影响相邻细胞的Notch1 受体表达，介导肿瘤细胞的增殖与恶性转化［19］。而在心血管系统中，心肌梗死后心肌细胞外泌体中的miR-1956 可激活Notch1 受体，使得脂肪间充质干细胞分泌VEGF，从而促进冠状动脉侧支血管生成［20］。在造血系统中，造血干细胞外泌体中的miR-126 可通过抑制Notch1 受体促进小鼠胚胎干细胞的体外造血分化［21］。另有研究发现，HIV 感染者血浆分离的 外 泌 体 中miR-10a-5p、miR-21-5p、miR-27b-3p、miR-122-5p、miR-146a-5p、miR-423-5p 表达显著增加，并预测这六种miRNA 可通过Notch1受体影响免疫细胞的分化［22］。由于外泌体对Notch 信号通路的受体、配体及胞内效应器分子均具有调控作用，外泌体中的miRNA 成分可作为诊断和预测疾病的功能性生物标志物［12］。除lncRNA 和miRNA 外，具有转录和加工功能的srpRNA 亦能参与外泌体对Notch信号通路的调控。RN7SL1这种srpRNA可与乳腺癌细胞及其肿瘤间质细胞表面的Nocth1 受体结合，使肿瘤细胞及其间质细胞内原癌基因myc 表达增加，而myc表达增加能够促进RN7SL1表达。因此，肿瘤细胞及其间质细胞外泌体中的RN7SL1 表达增加，这些外泌体再作用于肿瘤细胞及其间质细胞，形成正反馈效应，从而增强了乳腺癌的侵袭性［23］。

Notch 受体作为Notch 信号通路的核心部分，其调控机制多样，不仅受外泌体中各种蛋白的影响，同时也受外泌体中多种RNA 的调控。外泌体调控Notch 受体时信号传导是按照外泌体-Notch 受体-胞内效应器分子这一流程进行的，在干预Notch 信号通路的研究中，对受体的干预是最常见且最有效的。在未来的研究中，基于Notch 受体对Notch 信号通路进行调控可能在靶向治疗方面具有广阔的应用前景。

2.2 外泌体对Notch 配体的调控 Notch 配体是Notch 受体结合的信号分子。外泌体对Notch 配体的调控有两种方式。第一种调控方式：外泌体中含有Notch 配体，外泌体作用于靶细胞，Notch 配体直接作用于靶细胞的Notch 受体。在肿瘤进展过程中，肿瘤细胞通过增加周边细胞的可塑性、运动性和侵袭性，从而促进肿瘤细胞扩散，这一过程可通过肿瘤细胞外泌体中的Notch 配体实现。有研究认为，乳腺癌间质细胞分泌的外泌体能够抑制乳腺癌细胞上皮间质转化，增强乳腺癌细胞抗凋亡能力并降低其对化疗药物的敏感性，这可能与乳腺癌细胞中Dll4 配体高表达有关［16］。在结直肠癌细胞中，Jagged2 配体表达增加，肿瘤细胞释放富含Jagged2配体的外泌体，以旁分泌的方式作用于临近细胞，可促进结直肠癌细胞的迁移［24］。Notch 信号通路的配体亦可参与上皮细胞的转化调控，在皮肤细胞增殖过程中具有重要作用。胎儿真皮间充质干细胞外泌体中Jagged1 配体表达增加，外泌体中的Jagged1 配体激活了成纤维细胞的运动和分泌功能，从而加快伤口愈合［25］。第二种调控方式：外泌体的miRNA、lncRNA、蛋白等分子作用于靶细胞，调控靶细胞Notch 配体的转录与合成，由于Nocth 配体在细胞内合成后需要与其他细胞的Notch 受体结合才能发挥作用，因此这种方式信号级联放大效应更加明显。上皮细胞的上皮间质转化过程受Notch 信号通路的调控，在多种细胞中均有体现。Notch信号通路激活后，细胞黏附性降低、活动性增强，有利于细胞增殖。在稳定过表达HIF-1α 的骨髓间充质干细胞外泌体中，高表达的HIF-1α使血管内皮细胞的Jagged1配体含量增加，Jagged1通过激活Notch信号通路，促进了血管内皮细胞增殖，加速了血管生成［26］。起源于上皮组织的恶性肿瘤，同样与Notch 信号通路有着密切的联系。有研究认为，肿瘤细胞外泌体中的Dll4配体可转移至血管内皮细胞，导致Notch 信号通路被抑制，正常血管生成被抑制，肿瘤血管生成得到增强，从而促进肿瘤进展。黑色素瘤细胞起源于皮肤表皮，其活性同样受到Notch 信号通路的调控。黑色素瘤B16F0 细胞分泌的外泌体可通过miR-711、miR-1187 和miR-466 等miRNA 作用于靶细胞，促进与Notch 信号通路相关的配体表达，如Jagged1、Dll1，从而增强肿瘤的浸润性［27］。

外泌体调控Notch 配体时信号传导是按照外泌体-Notch 配体-Notch 受体-胞内效应器分子这一流程进行的，外泌体对Notch 配体的调控是基于完整的Notch 信号传导途径，而Notch 配体是Notch 信号通路的最上游环节，故对Notch 配体进行调控时级联放大效应更明显。

2.3 外泌体对Notch 胞内效应器分子的调控 外泌体除了通过Notch 受体和配体调控细胞活动外，还可通过干预Notch 信号的胞内效应器分子调控细胞活动。Notch 受体经过3 次裂解，胞内段进入细胞，在细胞核内与转录因子CSL及MAML结合，形成NICD-CSL-MAML 转录激活物复合体，激活Hes、Hey等bHLH 转录因子家族，从而发挥生物学效应。有研究发现，骨髓间充质干细胞分泌的外泌体中含有miR-142-3p，miR-142-3p 作用于结肠癌细胞可下调细胞内Notch 信号通路调节因子Numb，而Numb 作为抑癌基因，其表达缺失对肿瘤的发生、发展至关重要。Numb 表达下调可促进Notch 信号通路靶基因Hes1、p21、cyclin D3表达，增强结肠癌细胞的增殖能力［28］。外泌体不仅能作用于肿瘤细胞，提高肿瘤细胞的增殖能力，还可作用于正常细胞，抑制正常细胞的活动，增加肿瘤细胞的生存空间。骨肉瘤细胞的外泌体中存在Notch 激活因子，外泌体激活小鼠肌源性干细胞中的Hes1并抑制骨骼肌细胞生成，介导肿瘤恶病质中的骨骼肌萎缩［3］。而在感染性疾病中，被病毒感染细胞释放的外泌体同样可参与Notch信号通路的调控，从而参与病毒感染后的免疫应答。肿瘤细胞、正常上皮细胞受到Notch 信号通路的调控以正向调控为主，但被病原体感染的细胞常受到负向调控。幽门螺旋杆菌感染者血清中的外泌体可促进肠上皮细胞NLRP12表达，而NLRP12是一类T 细胞活化的负向调节分子，可调节病原体感染以及细胞损伤引起的炎症反应，能够抑制Notch 信号通路下游分子NICD、Hes1、Hes5、Hey1，降低趋化因子MCP-1、MIP-1α 表达，从而减轻炎症反应［29］。日本脑炎病毒感染的小胶质细胞释放的外泌体中含有let-7a/b，let-7a/b 可 与TLR7、NICD 相 互 作 用，TLR7 能够介导抗病毒的免疫反应，NICD 可激活Hes、Hey等Notch信号通路的靶基因，二者共同促进小胶质细胞释放TNF-α，从而增强炎症反应［30］。不仅如此，神经系统中神经干细胞分泌的外泌体中含有miR-9，miR-9 可通过旁分泌作用于其他神经干细胞的Hes1 靶点，能够促进神经干细胞分化，从而影响神经细胞变性后的修复过程。对于Notch信号通路的下游靶基因Hes1而言，神经干细胞分泌的外泌体中的miR-9是促进其表达的关键因素［31］。

外泌体调控Notch 胞内效应器分子时，外泌体携带的信号分子与靶细胞作用，直接干预靶细胞Notch信号的胞内效应器分子，不经过配体和受体的环节。外泌体对胞内信号传导的调控常常不仅限于Notch 信号通路，也包含Notch 信号通路之外的分子，可能涉及到多种信号通路复杂的交互作用，而对Notch信号通路的调控仅是其多种机制中的一环，特异性稍低。特别是在感染性疾病中，外泌体对炎症因子分泌的调节会同时涉及到NF-κB、JNK 及PI3KAkt等信号通路，其机制仍需进一步研究。

综上所述，外泌体作为传递细胞间信号的介质，可通过Notch 受体、配体以及胞内效应器分子三个层面参与Notch 信号通路的调控。外泌体调控Notch 受体时信号传导流程为外泌体-Notch 受体-胞内效应器分子，对Notch 受体的干预是最常见且最有效的。外泌体调控Notch 配体时信号传导流程为外泌体-Notch 配体-Notch 受体-胞内效应器分子，对Notch 配体进行调控时级联放大效应更明显。外泌体调控胞内效应器分子时信号传导流程为外泌体-胞内效应器分子，其机制较为复杂，涉及多种信号通路的协同作用。目前，外泌体对Notch 信号通路的调控机制尚未完全阐明，在不同环境、不同细胞中的作用是不完全相同的，值得继续深入研究，从而为肿瘤治疗、组织修复等提供新的思路。