神经病理性疼痛相关行为学的研究

贾丹丹，黄 诚

（1.赣南医学院2019级硕士研究生；2.赣南医学院基础医学院；3.赣南医学院疼痛医学研究所，江西 赣州 341000）

神经病理性疼痛（Neuropathic pain，NP）是临床上最易致残、难根治的一类疾病，严重影响患者身体健康及生活质量，其中包括躯体和情感方面，同时对家庭和社会造成一定负担。2011 年国际疼痛学会将神经病理性疼痛定义为“由躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛”［1］。神经病理性疼痛临床上表现为疼痛过敏、疼痛超敏和自发性疼痛［2］，其发病机制复杂、病理过程繁多、累及部位广泛，临床诊断尚无确切的“金标准”，由于受到临床医学伦理的限制，致使广泛应用动物作为研究神经病理性疼痛机制的主要模型，随后推荐相关行为学指标并对其进行量化。目前，通常依赖于机械痛、热痛和冷痛等经典行为学来评价神经病理性疼痛，但这些检测方法夹杂了主观因素，仍存在一定缺陷和不足，随着医学技术的发展，逐渐引入其他行为学，如步态行为、转棒实验和旷场实验等，与经典行为学检测互为补充，为综合评价神经病理性疼痛提供了更全面、客观、准确和统一的评判标准。基于此，本文对神经病理性疼痛相关行为学的研究进展进行归纳，旨在帮助科研人员根据自身实验需求选择更合适的行为学检测方法。

1 机械痛敏检测

神经病理性疼痛表现为与机械、热刺激等相关的痛觉过敏和痛觉超敏，同时伴有自发性疼痛，如刺痛、灼痛、跳痛和电击样痛等。疼痛过敏通常表现为痛阈降低，对伤害性刺激反应异常增强，疼痛延长，常用过寒温度或过热温度或针刺诱发进行评估。疼痛超敏由非伤害性刺激诱发，如触摸、震动、中度冷热等使疼痛加剧［3-5］。在大多数啮齿类动物模型中，对机械刺激的夸大反应被认为是异常感觉反应的关键指标，机械敏感度为引起行为反应所需力的大小。在基础研究中常用Von Frey纤维丝估算机械缩足阈值（Paw withdrawal threshold，PWT）［6-10］。机械痛是评价神经病理性疼痛的经典指标之一，它的检测以缩足反应为指标，用不同的力去刺激神经病理性疼痛大鼠相应区域，以出现缩足为准，记录相应的力度值即为机械阈值。Von Frey 实验主要针对机械刺激产生的针刺痛觉，以评估啮齿类动物的机械异常性疼痛。按照Up and down 方法，XUE M等［11］运用Von Frey 纤维丝对机械缩足阈值（Paw withdrawal threshold，PWT）进行评估，分别用不同力度标准化的Von Frey纤维丝对大鼠后肢足底皮肤进行测量，当出现阳性反应，即刺激时间内或移开纤维丝出现快速的缩足反应，需用相邻较小力度Von Frey纤维丝对其进行检测，如此反复进行，直至出现第一次阳性和阴性反应的骑跨，连续测量4次，之后依据文献报道计算50% PWT［6，12］，其优点是手动握持的，可以依据大鼠患肢位置进行调整，以此测量爪子的缩足阈值。但Von Frey纤维丝大量使用会产生损耗，随着检测力度的变化，纤维丝接触面积也会改变，为了获得阈值，需要使用多根纤维丝，应用Up and down 方法反复测量，这可能导致组织敏化，进而影响实验结果［13］。

近期有文献报道，XIA Y Y 等［14］采用动态足底触觉仪检测坐骨神经分支选择性神经损伤模型（Spared nerve injury，SNI）大鼠引起的机械痛敏，使用直径为0.5 mm 的Von Frey 纤维丝以递增的方式增加力度（0～50 g），直至达到缩爪阈值，该仪器的优点在于它的自动化，其纤维丝接触面积不会发生改变，在垂直方向上每秒产生恒定力（施力速度、方向保持一致性），且自动记录持续时间和爪缩回时的作用力，相比于Von Frey人工检测，动态足底触觉仪检测机械痛耗时更短，操作人员更便于检测，力的大小和增加量也可提前预置［15］。据报道，在神经病理性疼痛的动物模型中，爪子会发生一定程度的畸形，且足底姿势也会发生改变，如在SNI 模型中，分离结扎并剪断腓总神经和胫神经，保留腓肠神经，造模后会出现足外翻、跛行和行走困难等现象，而且如果需要检测后爪的足底外侧（腓肠神经支配皮肤区），加大了检测难度，往往需要多次重复测量［16-17］。动态足底触觉仪中的探针位置是固定不变的，不能进行相应的调整，可能会导致探针因爪子畸形或姿势改变发生滑落［15］。

2 热痛敏检测

哈格里夫斯实验（Hargreaves test）主要运用于评估啮齿类动物（如大鼠、小鼠）对热痛敏的反应，后来该实验被应用于神经损伤和再生后疼痛敏感化或热痛反应恢复的评价［18］。哈格里夫斯实验通常在玻璃板上进行，可以对其进行加热，测试时将聚焦红外光源移至检测相应区域，以观察动物后爪是否因热度产生缩足反应［仪器检测到动物后爪移动，控制器将自动关闭红外线停止计时器，即为热缩足潜伏期（Paw withdrawal latency，PWL）］［19］。在检测热痛敏过程中，需要密切观察实验动物是自愿移动爪子还是因高温而产生的缩足反应，因高温而产生的缩足反应常伴有舔足反应，此为典型的阳性结果。此外，要注意的是需提前设置最长刺激时间以免灼伤实验动物，影响后续实验结果。

哈格里夫斯实验方法检测热痛敏的优势在于它在不同部位的阈值相对恒定，但是需要人为去观察缩足反应是出于自主行为还是被动行为，或多或少存在一些主观性。此外，应选择合适的神经病理性疼痛模型评价动物对热刺激的反应性，如SNI 模型一般认为仅累及机械痛异常，热刺激的缩足潜伏期阈值尚不明显，但是热刺激可引起持续的缩足反应［20-21］。而慢性坐骨神经缩窄损伤（Chronic constrictioninjury of the sciatic nerve,CCI）模型、部分坐骨神经结扎（Partial sciatic nerve ligation，PSNL）模型和脊神经结扎（Spinal nerve ligation，SNL）模型普遍存在热痛敏现象，其中CCI 模型对热痛敏检测的敏感性最优［22］。

3 冷痛敏检测

大多数疼痛模型依赖于反射性实验评价其伤害性，如机械刺激、热刺激和冷刺激等，其中冷刺激最难检测。SMITH S B 等［23］发现，在给予紫杉醇腹腔注射的大鼠中，会产生一种持久的双侧神经病变，表现为对机械、热和冷刺激的超敏，用YOON C等［24］通过改进的丙酮实验检测冷痛阈值，并联合机械痛和热痛的检测方式，进一步探讨痛觉异常（机械、热和冷痛）是否依赖于基因型。其中，丙酮实验是将丙酮滴在实验动物后爪的足部区域来产生冷刺激，在接下来1 min 内观察实验动物舔或摇晃爪子反应的时间。丙酮刺激一般不会影响正常动物，但在产生冷痛敏的神经病理性疼痛模型动物中则会产生疼痛反应。正常大鼠对丙酮不敏感，所以该实验在检测大鼠中占优势［24-25］。此外，丙酮实验需要稳定的低温，且对周围环境要求较高，不适合精度要求高的动物实验［26］。

与丙酮实验相比，冷板实验（Cold-plate test）［27-28］更为客观，将实验动物放在一个冷却的金属板上，将金属板冷却到4 ℃，并计算5 min内的实验动物反应次数（爪抬起）。该实验受周围环境因素影响小，温度恒定，精密度高，但容易受机械刺激的影响，且仪器测试成本高。

4 步态分析

上述经典刺激诱发痛敏行为检测或多或少带有主观色彩，且易受实验环境和动物反应等因素影响。此外，在镇痛药作用于刺激诱发的痛敏行为中，出现的镇痛作用有可能阻断的是正常的保护性痛行为，可见，刺激诱发痛行为还存在缺陷与不足，尚需其他可靠且客观的行为学检测作为其辅助指标，进一步增强实验的准确性。文献报道，步态分析（Catwalk-Automated Gait Analysis）系统可以评估并分析啮齿类动物在自然行走情况下由于运动缺陷和疼痛引起的步态变化［29-31］。实验动物在不采取任何强迫措施下从步态分析系统的步行台一端行走到另一端，通过位于步行台下方的高速摄像机并采用脚印光亮折射技术捕捉实验动物的脚印，借助计算机对其脚步（尺寸、位置和压力等）和步态做出定性定量分析。近年来Catwalk 步态分析系统广泛用于评估神经病理性疼痛、炎性痛和脑损伤等模型［31-34］。

Catwalk 可以快速且客观地分析运动参数，在表现出机械痛敏的CCI 大鼠中，其步态参数中的足掌压力、站立时间和摆动时间与Von Frey 方法检测的机械痛敏呈高度相关，这可能提供了一种量化机械痛敏的替代方法［29］。HUEHNCHEN P等发现Catwalk步态分析系统可评价紫杉醇诱导的小鼠感觉性多发性神经病［35］。此外，佛甲草（Sedum lineare thunb，SLT）治疗可减轻神经病理性疼痛模型的相关疼痛行为（如机械痛敏），也可改善SNI 模型引起的站立时间、足印面积、足印长度、足印宽度的减少和摆动时间的增加，这表明，步态参数可作为药物作用于神经病理性疼痛疗效评估的依据之一［34］。

Catwalk 步态分析系统既可以分析啮齿类动物在行走过程中的动静态参数，也可反映肢体协调性［36］，通过趾端开口距和脚印长度计算出坐骨神经功能指数，并评估其恢复情况。该系统操作简单，可获取高通量、高质量的数据，且实时观测疼痛引起的相关参数变化，克服了上述机械痛敏和热痛敏检测所带来的主观因素影响。但是，在Catwalk步态检测中，实验动物可能会因为造模后出现患肢与地板接触力度减少甚至没有的现象（如SNI 模型），这会导致电脑分析脚印时不清晰，增加了数据整合难度，其灵敏度还需进一步提高［37］。

5 转棒实验

转棒实验（Rotarod test）用来评估动物在转杆上保持平衡的能力，随着转速提高，实验动物维持平衡难度加大，以此检测啮齿类动物的运动功能，转棒可用于疲劳试验、骨骼肌松弛试验、中枢神经抑制试验和其他需要此运动方式检测药物疗效的试验等［38-41］。近年来，转棒实验已被逐渐用于疼痛研究中，CHEN L 等将大鼠置于转棒上，转速从4 r·min-1提高到40 r·min-1，持续5 min，强迫大鼠向前行走以免掉落，实验前需连续训练2 天，每天3 次，以此观察不同剂量甘草素（Liquiritigenin）对CCI 大鼠运动功能的影响［42］。

步态实验观察了动物在不采取任何人为刺激下的自然步态变化，客观评估其四肢的协调性和局部运动功能等，而转棒实验则是评价动物的整体运动能力。文献报道，转棒实验已应用于评价药物对神经病理性疼痛模型中运动功能的影响［43］，为评估其疗效提供了更加可行的实验技术。然而，在转棒设备设计上的局限性，如通道宽度受限、转杆离底座的高度有限，使得成年大鼠在慢性实验中更易掉落或转身，进而中断实验并影响最终实验结果［44］。

6 旷场实验

神经病理性疼痛的发生机制复杂多样，往往加大临床治疗难度，而其伴随的焦虑、恐惧和抑郁等精神障碍更是对患者及其家庭和社会带来极大负面影响［45］。其中，在神经病理性疼痛的研究中，常用旷场实验（Open field test）评价动物的焦虑行为。AVILA-MARTIN G等［46］通过对痛敏行为检测，发现口服2-羟基乳清酸（2-hydroxyoleic acid，2-OHOA）可改善SNI 模型诱发的机械痛敏和热痛敏。此外，旷场实验显示，经2-OHOA 治疗后的SNI 大鼠，表现出在中央区的探索时间增加，减少了疼痛所引起的焦虑行为［46］。另有研究发现，皮下注射BONT/A（Botulinum toxin type A，BONT/A）可增加眶下神经远端慢性压迫性损伤（Chronic constriction injury of the distal infraorbital nerve，doIN-CCI）小鼠在旷场中心区的停留时间，并且显著降低了其排泄率，这表明，BONT/A缓解了doIN-CCI诱导的焦虑样行为［47］。

文献报道，旷场实验是检测动物情绪行为的一种常用技术［48］，旷场实验需将动物置于封闭的黑色箱底中心并进行摄像，同时传至电脑，利用软件实时监控实验动物在旷场内的活动轨迹，记录并分析活动距离、尿便次数、在周边运动距离以及中央运动距离等，进而观察实验动物在新环境的自主行为、探索行为和紧张度等［49］。一方面，旷场实验避免了人为观察的主观性、耗时耗力和标准不一等缺点，但其实验环境要求较高，需在安静和光强度、温湿度适宜的条件下进行。每次实验前都需清理旷场设备，以免动物遗留信息而影响下次实验结果。另一方面，旷场实验应根据动物实验模型选择合适的旷场箱尺寸、检测时间以及相应参数等，才可更充分获取实验所需的可靠数据信息［50-53］。

7 小结与展望

“类似疼痛”的行为学检测对探讨神经病理性疼痛的完整机制起着至关重要的作用，其中，诱发痛行为主要研究痛觉过敏，为神经病理性疼痛的经典行为学检测指标，常用于啮齿类动物研究。一般经典刺激如机械、温度和化学刺激等，此类行为学方法较为普遍且成熟，但对实验操作者要求较高，必须熟练掌握实验技术要点，诱发疼痛行为需要观察者判断实验动物的退避行为，主观因素较大。神经病理性疼痛模型除了影响动物的痛阈值，还会改变其运动协调能力，相比之下，步态分析、转棒实验和旷场实验更为客观地量化神经病理性疼痛所造成的局部运动障碍、整体运动能力和伴随情绪焦虑的差异及其干预之后的变化。表明多种行为学检测方法相辅相成，互为补充，有助于神经病理性疼痛的发病机制和镇痛策略研究。此外，在模拟和评价神经病理性疼痛所致症状及其治疗效果时，应根据疼痛模型特点充分权衡其相关行为学方法的利弊，择优选择客观、可靠的疼痛评估和检测方法。