酮咯酸通过胰岛素样生长因子2信号通路抑制卵巢癌的生长和转移

冯艳坤，陈治军

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是一种严重威胁世界女性生命的恶性肿瘤，其死亡率居女性癌症之首［1］。卵巢癌具有高复发率、高侵袭性及易耐药的特性，以至于其预后极差［2-4］。因此，开发新的治疗药物意义重大。非甾体类抗炎药物（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）目前在一些国家作为止痛剂用于原发性癌症的手术，酮咯酸为其中之一［5］。胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）信号通路在很多肿瘤中均表现出活性异常升高，包括卵巢癌［6-7］。研究表明，酮咯酸可以减少乳腺癌的复发，其在卵巢癌中具发挥抑制癌症恶化的作用，但是其具体的作用机制与IGF2信号通路之间的关系尚缺乏理论依据。本研究于2019年8月至2020年3月以卵巢癌细胞为研究对象，观察酮咯酸对卵巢癌细胞迁移侵袭及卵巢癌肿瘤的影响，其揭示其机制与酮咯酸抑制IGF2信号通路活性有关，将可为酮咯酸在卵巢癌治疗中的应用提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料人卵巢癌细胞SKOV3购自美国菌种保藏中心（american type culture collection，ATCC）；无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级BALB∕C裸鼠（18～20 g）30只，购自湖南斯莱克实验生物有限公司，动物使用许可证号为SCXK（湘）2016-0002，本研究符合一般动物实验伦理学原则；酮咯酸注射液购自辉瑞公司；IGF2信号通路特异性抑制剂Linsitinib购自MCE；杜氏细胞培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）购自Hyclone公司；胎牛血清均购自杭州四季青；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒购自GLPBIO；Transwell小室购自corning；LipofectamineTM2000购自Invitrogen；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购自上海安普公司；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）试剂盒购自北京Leagene；电化学发光（electronics components laboratory，ECL）试剂盒和RIPA蛋白裂解液购自碧云天；兔抗人IGF2、胰岛素样生长因子1受体（Insulinlike growth factor 1 receptor，IGF1R）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗体及兔抗鼠IGF2、IGF1R和GAPDH多克隆抗体购自武汉博士德。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养卵巢癌细胞SKOV3使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染与分组SKOV3细胞分为正常对照组（NC组）、不同浓度（0.10 g∕L、0.50 g∕L、1.00 g∕L、1.50 g∕L）酮咯酸组。NC组细胞正常培养基培养48 h；酮咯酸组细胞分别用含0.10 g∕L、0.50 g∕L、1.00 g∕L、1.50 g∕L酮咯酸培养48 h。将二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解的1 μmol的Linsitinib处理的SKOV3细胞标记为Linsitinib组，含等量DMSO的培养基处理的SKOV3细胞标记为DMSO组。用脂质 体法 将pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-IGF2转染 至SKOV3细胞，并用1.00 g∕L的酮咯酸处理48 h，分别标记为酮咯酸+pcDNA 3.1组、酮咯酸+pcDNA 3.1-IGF2组。

1.2.3 CCK-8法检测细胞抑制率调整细胞至105个∕毫升，接种到96孔板，置于细胞培养箱中培养48 h。每孔加入CCK-8溶液20 μL，490 nm波长测吸光度（optical density，OD）值。细胞存活率（%）=（1-OD实验组∕OD对照组）×100%。

1.2.4 Transwell小室检测细胞迁移侵袭收集细胞，用不含血清的培养基培养12 h，然后取100 μL加入小室上室内。在小室下室加入含有胎牛血清的培养基600 μL。将小室置于细胞培养箱中培养48 h，取出后用棉签轻轻拭去上室下表面的细胞，然后对细胞进行甲醇固定和结晶紫染色，最后在显微镜下对细胞进行拍照，计数。

细胞的迁移和侵袭检测均按照以上操作方法进行，不同之处在于检测侵袭所选用的小室膜上表面铺有基质胶，需要在37℃温箱进行凝固。

1.2.5 蛋白质印迹法检测细胞中IGF2、IGF1R的蛋白表达收集细胞或研磨好的肿瘤组织，用细胞裂解液对其裂解，结束后，用沸水浴法对蛋白进行变性，12 000 rpm，离心5 min，取上清液，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量。将准备好的双层电泳胶中的梳子轻轻拔出，小心将样品打入梳子孔，避免产生气泡。打开电泳槽电源先进性稳流电泳，再进行稳压电泳。结束后，在转膜仪上进行低温转膜，然后进行脱脂奶粉封闭2 h。最后将稀释好的兔抗人IGF2（1∶1 000）、IGF1R（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）一抗进行4℃孵育24 h。洗膜3次，在用稀释好的山羊抗兔二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，结束后洗膜。显影曝光，用ECL显影试剂盒在暗室中进行显影、曝光和定影。最后用Quantity One凝胶分析软件对胶片进行处理，测定各组蛋白条带的吸光度，以目的条带和GAPDH条带的比值作为蛋白表达水平。

1.2.6 裸鼠成瘤实验取0.2 mL浓度为1×106个∕毫升的卵巢癌SKOV3细胞，接种至裸鼠右前肢，SPF环境下继续饲养。接种后1周后，出现肉眼可见的肿瘤。然后把SPF裸鼠分为NC组和酮咯酸组，每组10只。酮咯酸组裸鼠灌胃5 mg∕kg酮咯酸，NC组裸鼠灌胃等量生理盐水，每3天灌胃1次。每周1次，测量肿瘤的最长直径a（mm）和最短直径b（mm），肿瘤体积V=a×b2×0.52计算肿瘤体积（mm3），取平均值。第21天时处死裸鼠，小心剥离肿瘤组织，称量瘤体质量。蛋白质印迹法检测组织中IGF2、IGF1R蛋白表达，其中IGF2、IGF1R稀释度均为1∶1 000。

1.3 统计学方法实验中所用数据均采用SPSS 21.0软件进行分析。计量资料用±s表示，多组间多重比较采用one-way ANOVA单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni校正的t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 酮咯酸对卵巢癌细胞的抑制作用NC组、不同剂量（0.10 g∕L、0.50 g∕L、1.00 g∕L、1.50 g∕L）酮咯酸组细胞抑制率分别为（0.02±0.00）%、（6.99±0.06）%、（23.31±2.11）%、（51.39±6.91）%、（76.14±4.36）%，五组间比较差异显著（F=639.34，P＜0.001）。与NC组相比，不同剂量（0.10 g∕L、0.50 g∕L、1.00 g∕L、1.50 g∕L）酮咯酸组SKOV3细胞抑制率均显著升高（P＜0.001），且具有剂量依赖性。由于1.0 g∕L的酮咯酸对SKOV3细胞的抑制率接近50%，故选用1.0 g∕L酮咯酸用于后续研究。

2.2 酮咯酸对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响NC组、酮咯酸组细胞迁移数分别为（103±9）个、（54±5）个，侵袭数分别为（76±6）个、（41±4）个。与NC组相比，酮咯酸组细胞迁移数和侵袭数均显著降低（t=14.27、14.56；均P＜0.001），见图1。

2.3 酮咯酸对卵巢癌细胞中IGF2信号通路的影响NC组、酮咯酸组细胞中IGF2蛋白表达分别为1.01±0.06、0.31±0.03，IGF1R蛋白表达分别为0.99±0.08、0.26±0.02。与NC组相比，酮咯酸组细胞中IGF2和IGF1R蛋白表达均显著降低（t=31.30、26.55；均P＜0.001）。见图2。

图2 酮咯酸对SKOV3细胞中IGF2和IGF1R蛋白表达的影响

2.4 IGF2抑制剂对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响与NC组或DMSO组相比，Linsitinib组细胞中IGF2和IGF1R蛋白表达均显著降低（P＜0.001），细胞迁移数和侵袭数均显著降低（P＜0.001），而NC组与DMSO组各检测指标比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3，4；表1。

图3 IGF2抑制剂对SKOV3细胞中IGF2和IGF1R蛋白表达影响

表1 IGF2抑制剂对SKOV3细胞中IGF2、IGF1R蛋白表达及迁移和侵袭的影响

表1 IGF2抑制剂对SKOV3细胞中IGF2、IGF1R蛋白表达及迁移和侵袭的影响

注：IGF2为胰岛素样生长因子2蛋白，IGF1R为胰岛素样生长因子1受体蛋白。①与NC组或DMSO组比较，P＜0.05。

组别NC组DMSO组Linsitinib F值P值重复次数9 9 9 IGF2 0.98±0.05 1.00±0.07 0.28±0.02①582.00＜0.001 IGF1R 0.99±0.06 1.02±0.08 0.29±0.02①442.99＜0.001迁移98±9 99±7 63±6①68.36＜0.001侵袭73±6 75±6 51±5①49.36＜0.001

2.5 过表达IGF2逆转了酮咯酸对卵巢癌细胞迁移和侵袭的抑制作用与酮咯酸组或酮咯酸+pcDNA 3.1组相比，酮咯酸+pcDNA 3.1-IGF2组细胞中IGF2和IGF1R蛋白表达均显著升高（P＜0.05），细胞迁移数和侵袭数均显著升高（P＜0.05），而酮咯酸组与酮咯酸+pcDNA 3.1组各检测指标比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5，6；表2。

图5 过表达IGF2逆转了酮咯酸对SKOV3细胞中IGF2、IGF1R蛋白表达及迁移和侵袭的影响

表2 过表达IGF2逆转了酮咯酸对SKOV3细胞中IGF2、IGF1R蛋白表达及迁移和侵袭的影响∕s

表2 过表达IGF2逆转了酮咯酸对SKOV3细胞中IGF2、IGF1R蛋白表达及迁移和侵袭的影响∕s

注：IGF2为胰岛素样生长因子2蛋白，IGF1R为胰岛素样生长因子1受体蛋白。①与酮咯酸对+空载体组比较，P＜0.05。

组别酮咯酸酮咯酸+pcDNA 3.1酮咯酸+pcDNA 3.1-IGF2 F值P值重复次数9 9 9 IGF2 0.31±0.03 0.33±0.04 1.28±0.13①427.69＜0.001 IGF1R 0.26±0.02 0.27±0.03 1.19±0.12①490.53＜0.001迁移52±5 53±5 87±7①108.27＜0.001侵袭44±4 42±4 75±6①135.92＜0.001

2.6 酮咯酸对裸鼠成瘤及IGF2信号通路的影响与NC组相比，酮咯酸组裸鼠肿瘤的质量和体积均显著降低（P＜0.001），肿瘤组织中IGF2和IGF1R蛋白表达均显著降低（P＜0.001）。见图7，表3。

图7 酮咯酸对裸鼠肿瘤组织中IGF2和IGF1R蛋白表达的影响

表3 酮咯酸对裸鼠肿瘤生长和IGF2和IGF1R蛋白表达的影响∕

表3 酮咯酸对裸鼠肿瘤生长和IGF2和IGF1R蛋白表达的影响∕

注：IGF2为胰岛素样生长因子2蛋白，IGF1R为胰岛素样生长因子1受体蛋白。①与NC组比较，P＜0.05。

组别NC组酮咯酸t值P值重复次数10 10肿瘤灶质量1.01±0.07 0.53±0.05①17.65＜0.001肿瘤灶体积1.00±0.04 0.55±0.05①22.22＜0.001 IGF2 0.99±0.08 0.46±0.04①18.74＜0.001 IGF1R 0.97±0.09 0.52±0.05①13.82＜0.001

3 讨论

酮咯酸在癌症治疗中可用于控制癌症相关的疼痛，并在癌症手术期间和手术后用作止痛剂［8-9］。随着分子生物技术的不断发展，酮咯酸在癌症中的新功能也不断被发现。Desmedt等［10］在研究中发现，酮咯酸治疗可以明显的降低原发性乳腺癌治疗后的复发率，这是酮咯酸在乳腺癌治疗中发现的新功能，为酮咯酸的功能开发提供参考。在卵巢癌的系列研究中报道，酮咯酸可通过直接作用于细胞分裂 控 制 蛋 白42（cell division control protein 42，Cdc42）和Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物（Substrates of Ras-associated C3 botulinum toxin，Rac1）参与卵巢癌细胞的迁移侵袭能力的调控［11-12］。最近，Hudson等［13］阐明，反式手性的酮咯酸在疼痛控制中具有功效，顺势手性的酮咯酸可能够通过Rac1、Cdc42在癌症中发挥益处，二者在卵巢癌中具有不同的作用靶点。

基于以上研究成果，我们推测酮咯酸对卵巢癌细胞和肿瘤生长应该具有一定的调控作用。本研究检测了酮咯酸处理的卵巢癌细胞的抑制率发现，酮咯酸可呈浓度依赖性抑制卵巢癌细胞，且可明显抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭；重要的是，酮咯酸还可以抑制体内裸鼠成瘤的生长，这说明酮咯酸在卵巢癌中确实具有抑制癌症进一步恶化的功能，这个实验结果与相关报道结果一致［14］。深入研究，通过蛋白质印迹法检测酮咯酸处理的卵巢癌细胞中IGF2信号通路关键蛋白IGF2、IGF1R的表达发现，酮咯酸可下调IGF2、IGF1R表达，抑制IGF2信号通路的活性，猜测IGF2信号通路可能参与酮咯酸在卵巢癌中的功能。

IGF2信号通路具有多种生长因子受体，包括胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）、胰岛素受体（insulin receptor，IR），这些受体在与它们各自的胰岛素生长因子配体IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ结合后被激活，并在肿瘤的发展、存活和化学治疗中起重要作用［15-17］。在许多临床前研究中，抗IGF-1R∕IR靶向策略被证明可有效减少卵巢癌的生长［18］。Tian等［19］在研究中发现，胰岛素样生长IGF2信号通路通过右美托咪定的介导对卵巢癌大鼠免疫功能及癌细胞侵袭迁移产生影响。Gao等［20］在卵巢癌的研究中发现，上调IGF2能够促进卵巢癌的进一步恶性化发展。由此可见，IGF2信号通路在卵巢癌中的功能已得到肯定，推测其与酮咯酸的功能之间应该也存在一定联系。

本研究检测了酮咯酸处理的卵巢癌细胞中IGF2信号通路的活性发现，酮咯酸可抑制该通路的活化，这也说明了酮咯酸在卵巢癌中发挥抗癌作用。进一步研究发现，抑制IGF2信号通路能够促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭，而激活IGF2信号通路则能够逆转酮咯酸对卵巢癌细胞的迁移侵袭抑制作用，这个结果说明了不仅酮咯酸能够抑制IGF2信号通路的活性，相反，IGF2信号通路也可以反向逆转酮咯酸对卵巢癌细胞迁移侵袭的抑制作用。为了更充分的揭示酮咯酸在卵巢癌中与IGF2信号通路之间的作用关系，我们又进行了体内裸鼠成瘤实验发现，酮咯酸不仅可抑制裸鼠体内卵巢癌肿瘤的生长，还可抑制IGF2信号通路的活性。

综上所述，酮咯酸可抑制卵巢癌细胞的迁移侵袭和肿瘤的生长，其机制与失活IGF2信号通路相关，为酮咯酸用于卵巢癌的临床治疗提供一定的理论依据。

（本文图1，4，6见插图1-7）