基于网络药理学和分子对接技术探讨芪藤消浊颗粒治疗慢性肾小球肾炎的作用机制

程雨，张磊，王亿平

慢性肾小球肾炎（chronic glomerulonephritis，CGN）又称慢性肾炎（chronic nephritis，CN），病理以肾小球损害为主，肾小球系膜细胞的异常增殖和肾小管间质区免疫介导的炎症反应在CGN的进展中发挥关键作用［1-2］。CGN是导致慢性肾脏病最常见的病因，最终可发展为终末期肾脏病。目前慢性肾炎的治疗没有特异性方法，主要以防止和延缓肾功能进行性恶化、改善临床症状为目的。中药复方因其安全性良好，同时具有多成分、多靶点、多通路治疗疾病的特点逐渐受到关注。

中医认为脾虚、湿浊、血瘀在CGN基本病机中起关键作用，安徽中医药大学第一附属医院国家级名老中医曹恩泽先生提出“补脾、行水、化瘀”理论，并以此为组方原则创立芪藤消浊颗粒（曾用名：肾康颗粒、肾康冲剂，批号为皖药制字20170520）治疗CGN［3］。芪藤消浊颗粒临床用于治疗慢性肾小球肾炎已有长达20多年的历史，前期的临床研究结果表明，芪藤消浊颗粒能有效改善CGN病人的临床症状，其作用机制可能包括降低尿蛋白、改善肾功能、调节细胞免疫功能以及抑制炎症反应等，且未见明显毒副作用［4-7］；动物实验研究证实，芪藤消浊颗粒能有效治疗阿霉素诱导的CGN大鼠模型，其作用机制包括调节炎性因子及炎症基因的表达、抑制炎症信号通路等［8］。但是，其具体、综合的相关作用机制还有待进一步的探索。本研究旨在通过网络药理学和分子对接技术分析临床疗效确切的芪藤消浊颗粒治疗CGN的作用机制，为临床应用奠定基础，为进一步实验研究提供理论思路。

1 资料与方法

1.1 收集复方活性成分将芪藤消浊颗粒（黄芪、雷公藤、益母草、薏苡仁、白茅根、白花蛇舌草、蝉蜕）输入TCMSP（https：∕∕tcmsp-e.com∕）数据库［9］进行检索，以OB≥30%、DL≥0.18筛选和收集所有满足条件的活性成分［10］。蝉蜕因未被收录在TCSMP数据库中，故通过TCMID（http：∕∕www.megabionet.org∕tcmid∕）［11］和HERB（http：∕∕herb.ac.cn∕）数据库［12］查询其化合物作为补充。在Pubchem（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov∕）数据库检索蝉蜕所有化合物成分的SMILES结 构 式，输 入FAFDrugs4（https：∕∕fafdrugs4.rpbs.univ-paris-diderot.fr∕）数据库，以系统自带算法“Drug-like soft”作为筛选条件将结果显示为“accept”的活性成分纳入［13］。

1.2 药物靶点预测在TCMSP数据库中搜索药物活性成分对应的靶点信息，运用SwissTargetPrediction（http：∕∕www.swisstargetprediction.ch∕）、SEA（https：∕∕sea.bkslab.org∕）数据库对蝉蜕活性成分进行靶点预测。通过UniProt（https：∕∕www.uniprot.org∕）数据库以“Reviewed”和“Human”作为筛选条件将靶点蛋白转化为基因名称，未完成转化的靶点蛋白再通过STRING（https：∕∕string-db.org∕）数据库转化作为补充。

1.3 获取慢性肾小球肾炎疾病基因运用OMIM（https：∕∕www.omim.org∕）［14］、DrugBank（https：∕∕go.drugbank.com∕）［15］、GeneCards（https：∕∕genealacart.genecards.org∕）［16］、PharmGkb（https：∕∕www.pharmgkb.org∕）、TTD（http：∕∕db.idrblab.net∕ttd∕）数 据 库［17］，以“chronic glomerularnephritis”“chronic nephritis”作为搜索关键词，种属选择“Home sapiens”，获取慢性肾小球肾炎的疾病靶点，整理剔除假阳性结果，运用Draw Venn Diagram（http：∕∕bioinformatics.psb.ugent.be∕webtools∕Venn∕）软件制作韦恩图，并获取并集疾病基因信息。

1.4 获取药物与疾病交集基因分别将“1.2”项所得的药物活性成分基因和“1.3”项所得的疾病基因导入Draw Venn Diagram软件制作韦恩图，得出二者交集基因信息。

1.5 构建“中药活性成分-交集基因”网络分别用“1.1、1.2、1.4”项中获取的中药活性成分、靶点及交集基因制作“network”“type”“list”文本文件，导入Cytoscape 3.8.2软件绘制“中药活性成分-交集靶点”网络图，并根据degree值的大小设定活性成分节点的大小，degree值越大，活性成分节点面积越大。

1.6 构建蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）［18］网络及核心基因筛选网络将“1.4”项所得的药物与疾病的交集基因信息导入STRING数据库，物种设置为人，隐藏网络中游离的节点，最低交互分数设定为0.900，构建芪藤消浊颗粒治疗CGN PPI网络，并下载tsv格式文件，将其导入Cytoscape 3.8.2软件对数据进行可视化分析，通过其插件CytoNCA分析网络中靶点的拓扑参数，根据节点连接度（degree centralities，DC）、介数中心性（betweenness centralities，BC）、接近中心性（closeness centralities，CC）、本征向量中心性（eigenvector centralities，EC）为筛选条件评价基因的重要性，找出每个条件大于中位值的基因再次构建网络，依此循环，筛选出基因功能关联网络的核心基因。

1.7 基因本体论（GO）功能与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析将药物与疾病交集基因导入DAVID（https：∕∕david.ncifcrf.gov∕）数据库［19］，分别选择生物学过程（biological processes，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞成分（cellular composition，CC）进行GO富集分析，将校正P值筛选条件设置为≤0.05；KEGG通路富集分析，校正P值设定为≤0.01。通过OmicShare基迪奥生物信息云平台（https：∕∕www.omicshare.com∕）绘制GO富集条形图和KEGG通路气泡图。

1.8 分子对接将“1.5”项所得的关键活性成分作为小分子配体，“1.6”项中筛选的核心靶点作为受体蛋白，运用Pubchem数据库（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载关键活性成分2D结构的SDF格式文件；通过Uniprot数据库［20］查找核心靶点，尽可能筛选分辨率高、单链∕双链的晶体结构，并在PDB数据库（https：∕∕www.rcsb.org）下载相应晶体结构的PDB格式文件。采用SailVina平台进行Autodock vina分子对接。用OpenBabel软件将分子对接结果pdbqt格式转化为pdb格式文件，导入PyMOL软件进行可视化分析，并运用PLIP（https：∕∕plip-tool.biotec.tu-dresden.de∕plip-web∕plip∕index）网站［21］确定结合位点，并将结合位点文件导入PyMOL软件标记结合位点氨基酸残基。

2 结果

2.1 芪藤消浊颗粒潜在活性成分及靶点预测获取芪藤消浊颗粒活性成分102个，其中黄芪20个，雷公藤51个，益母草8个，白花蛇舌草7个，薏苡仁9个，白茅根4个，蝉蜕3个（表1）。综合TCSMP、SwissTargetPrediction、SEA数据库得到靶点蛋白共1 655个，经Uniprot、STRING数据库对靶点蛋白标准化处理，删除重复值，得到235个基因。

表1 芪藤消浊颗粒“中药-活性成分-靶点”信息∕个

2.2 不同数据库慢性肾小球肾炎疾病基因获取删除重复值后，5个不同疾病基因数据库共收集并集基因1 847个（图1），其中GeneCards数据库1 789个，OMIM数 据 库19个，PharmGkb数 据 库64个，TTD.数据库19个，DrugBank数据库5个。

2.3 构建药物活性成分与疾病基因交集药物活性成分靶点对应的基因与疾病基因取交集，235个药物活性成分靶点对应的基因与1 847个疾病基因取交集，得到交集基因134个。

2.4 构建芪藤消浊颗粒“中药活性成分-交集靶点”网络剔除没有对应靶点或重复的活性成分，“中药活性成分-交集靶点”网络（图2）共有183个节点，包括49个活性成分节点，134个靶点节点，511条边。得出degree值最大的前3个活性成分分别是quercetin（槲皮素）（degree=87）、Kaempferol（山柰酚）（degree=32）、triptolide（雷公藤内酯）（degree=31）。

2.5 交集基因蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络和网络核心基因获取运用STRING数据库构建交集基因PPI网络（图3），该网络有115个节点，496条边。其中节点代表蛋白质，不同节点颜色代表蛋白质不同作用的外壳，边代表蛋白质-蛋白质关联，不同颜色代表基于不同的证据类型，包括文本挖掘、实验研究、数据库、共表达、邻居节点、基因融合以及共定位。经过对网络拓扑参数进行四次筛选（图4），最终获取5个核心基因，分别为MAPK1、JUN、STAT3、RELA、IL6（表2）。

表2 芪藤消浊颗粒治疗慢性肾小球肾炎的核心基因筛选

2.6 芪藤消浊颗粒治疗慢性肾小球肾炎的交集靶点GO富集分析、KEGG通路富集分析在DAVID数据库中，输入交集基因通过筛选条件进行GO功能注释，获得BP富集条目393条，主要与炎症反应、老化、免疫应答、对缺氧的反应、氧化应激反应、细胞对脂多糖的反应、凋亡过程的负面调节、细胞增殖的正调控、血小板激活、缺乏配体的外源性凋亡信号通路等关系密切；CC富集条目36条，包括细胞质基质、细胞膜、外泌体、细胞外基质等；MF富集条目75条，主要与酶结合、蛋白质结合、转录因子结合、酶活性、蛋白质活性、细胞因子活性和转录因子活性等相关。通常认为富集P值越小与疾病之间的关系越密切，故截取P值最小的前20条目展示（图5）。

KEGG通路经过富集阈值P≤0.01的drugs-disease筛选条件共得到216条通路，筛选前20条信号通路进行展示（图6），主要包括TNF信号通路、TOLL样受体信号通路、HIF-1信号通路、NOD样受体信号通路、NF-κB信号通路等。

2.7 核心活性成分与核心靶点分子对接将筛选得到的3个核心活性成分作为配体与5个核心靶点蛋白（MAPK1、JUN、STAT3、RELA、IL6）作为受体进行分子对接。核心靶点蛋白PDB ID的选取及其与活性成分的结合能信息见表3。对接结果显示槲皮素、山柰酚、雷公藤甲素能够通过形成氢键、盐桥、疏水作用和阳离子-π用于核心靶点蛋白稳定地对接，并且具有较好的结合活性。

表3 芪藤消浊颗粒治疗慢性肾小球肾炎核心活性成分与核心靶点蛋白结合能

3 讨论

中药方剂是中医药理论的主要表现形式，是中医整体观念和辩证论治思想集中体现。面对日新月异的现代医学发展，课题组结合蛋白组学及转录组学多层次多参数地为芪藤消浊颗粒治疗慢性肾炎作用机制研究奠定了扎实的基础［22-26］。而网络药理学的兴起为进一步研究中药复方提供了新方向，通过构建活性成分群与疾病靶点蛋白网络直观地揭示了芪藤消浊颗粒可以通过多成分、多靶点发挥治疗慢性肾小球肾炎的效用。

本研究发现，芪藤消浊颗粒重要潜在活性成分共49种，根据相关文献研究报道，筛选得到的核心活性成分槲皮素、山柰酚、雷公藤甲素等均具有强大的抗炎潜力和免疫调节作用。槲皮素作为一种有效抗炎物质，其作用机制可能是抑制中性粒细胞IL-6的表达改善炎症反应［27］；通过阻止促炎细胞因子TNF-α、IL-1β激活细胞外信号相关激酶（ERK）、应激激活蛋白激酶（JNK）与核因子κB（NF-κB），抑制细胞中炎性细胞因子和趋化因子的产生，增强抗炎因子活性，从而拮抗炎症基因的转录活性，直接或间接地抑制炎症基因表达［28-29］。山柰酚可通过抑制脂氧合酶（5-LOX）途径［30］，显著性抑制细胞炎症介质前列腺素（PGE2）［31］、炎性细胞因子、环氧合酶2（COX2）的表达，抑制一氧化氮合酶（NOS）和一氧化氮（NO）的产生，从而在炎症级联反应，特别是在炎症的关键启动步骤和信号传导方面发挥调节作用［32-33］；同时通过抑制NF-κB及相关转录因子的活性参与调节机体免疫功能［34］。雷公藤甲素能抑制炎性细胞因子趋化、炎症介质（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8）产生与释放，抑制炎症信号通路（Toll样受体信号通路、MAKP信号通路、NF-κB信号通路）、调节炎症基因（miR-224-3p、miR-130a）功能表达从而抑制炎症反应［35-36］。

PPI网络拓扑参数分析结果显示，MAPK1、JUN、STAT3、RELA、IL6为排列前五的关键靶点。MAPK1作为MAPK信号转导途径的重要组成部分，在MAPK∕ERK信号级联中起着关键调节作用。参与激活炎症反应启动的信号级联，通过转录、翻译、细胞骨架重新排列来调节细胞增殖、黏附、凋亡和分化等多种生物功能［37］。IL-6作为攻击性炎症介质，参与启动和维持免疫调节中的炎症反应，通过自分泌及旁分泌促进肾小球系膜细胞增殖和系膜基质增多，参与诱导内皮细胞毒性反应，发挥致肾小球炎症作用，同时可导致肾组织免疫损伤［38］。STAT3是参与肾脏炎症反应的重要信号分子，STAT3表达高低与间质炎症浸润程度相关［39］。JUN可引起与凋亡有关的基因的过度表达，诱发机体内炎性因子的大量产生与释放［40］。RELA-NFKB1复合物作为多效性转录因子，是一系列信号转导事件的终点，参与机体内炎症、免疫等多种生物学过程，也是T细胞中细胞因子基因表达所必需的［41］。这些因子均可直接或间接地参与细胞增殖、分化及介导免疫炎症反应，芪藤消浊颗粒很可能是通过调节上述靶基因，从而影响CGN的疾病进展。结合分子对接结果分析，配体与受体的结合能大多数均≥-7.0 kJ∕mol，且结合位点成键多，均有稳定的氢键和疏水键，提示构象稳定，充分体现了芪藤消浊颗粒治疗CGN的作用机制可能与通过多成分作用于多靶点发挥调节免疫介导抗炎反应有关。

KEGG通路富集分析前20条信号通路，其中NFκB信号通路能够调节细胞凋亡、免疫反应，诱导炎性因子的表达，促进肾小球基底膜硫酸类肝素蛋白多糖分解代谢，致使肾小球滤过屏障受损，形成蛋白尿［42］。肿瘤坏死因子（TNF）是触发机体免疫和炎症反应的重要细胞介质，TNF信号通路还可通过家族蛋白的募集激活多种信号转导途径，包括NF-kB和MAPK途 径，调 控细胞 凋 亡和免 疫炎症 反 应［43］。TOLL样受体信号通路与NOD样受体信号通路在炎症、免疫细胞调控方面发挥协同作用，均能够通过对病原相关分子模式（PAMPs）的识别，快速激活接头蛋白、信号复合体和NF-κB转录因子负责的细胞内信号级联反应，调节机体内促炎细胞因子、抗炎细胞因子及趋化因子的产生与释放，激活启动多种免疫反应［44］。HIF-1信号通路可在自身免疫性疾病病人炎症部位低氧环境下被激活，HIF可以激活NFκB信号通路刺激免疫细胞对低氧的应答，从而导致下游炎性因子基因转录激活［45］。芪藤消浊颗粒可能通过调节与CGN发病机制密切相关的通路发挥抗炎及免疫调节作用。

综上所述，本研究运用网络药理学方法和分子对接技术对中药复方芪藤消浊颗粒治疗慢性肾炎的分子机制进行阐述，认为其可能与复方中所含的多种有效成分协同作用参与调节炎症基因表达、抗炎因子和炎性细胞活性，调控免疫炎症相关信号通路转导有关。

（本文图1～6见插图1-2）

图1 不同数据库慢性肾小球肾炎疾病基因并集图 图2 芪藤消浊颗粒治疗慢性肾小球肾炎“中药活性成分-靶点”网络图 图3 芪藤消浊颗粒治疗慢性肾小球肾炎交集基因蛋白质-蛋白质相互作用网络 图4 蛋白质-蛋白质相互作用网络拓扑结构筛选核心基因 图5 芪藤消浊颗粒治疗慢性肾小球肾炎的作用靶点GO生物学功能注释富集分析 图6 芪藤消浊颗粒治疗慢性肾小球肾炎的作用靶点KEGG 通路富集分析