白花蛇舌草对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞增殖、凋亡、活性氧水平的影响研究

李祥芸，朱祥祥，徐涛

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病微血管最严重的并发症之一，也是致盲的一个重要因素，且发病率呈现逐年上升趋势［1-2］。人视网膜血管内皮细胞（HRCECs）损伤是DR发生的基础，目前认为高血糖是引起DR的重要因素，持续的高血糖引起的视网膜组织微血管内皮细胞损伤是DR出现血管病理改变的始动因素［3］。白花蛇舌草（HDW）是一种茜草科一年生草本植物，广泛分布在亚热带地区，现研究发现其具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、免疫增强功能、神经保护等功能［4-5］。有研究显示，白花蛇舌草可通过调节免疫系统对治疗突眼有一定的效果［6］。白花蛇舌草可影响HRCECs增殖及VEGF表达［7］，但白花蛇舌草是否可影响HRCECs周期、凋亡及氧化应激尚未明确。本研究于2019年10月至2020年6月，体外培养HRCECs，旨在探讨白花蛇舌草注射液（HDI）对高糖诱导的HRCECs增殖、周期、凋亡及活性氧水平影响，并进一步研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器白花蛇舌草注射液购自吉林通化振国药业有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、青链霉素、二甲基亚砜均购自美国Gibco公司；CCK8细胞活性检测试剂盒购自日本Dojindo公司；细胞周期检测试剂盒、活性氧检测试剂购自南京凯基生物科技公司；流式细胞仪和Annexin V-FITC∕PI双染法细胞凋亡试剂盒均购自美国BD公司；ECL试剂盒购自美国Invitrogen公司；BCA试剂盒购自美国Pierce公司；增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞周期蛋白A1（CyclinA1）和活化胱天蛋白酶-3（cleaved caspase-3）抗体购自美国Abcam公司；酶标仪购自美国Thermo公司。

1.2 细胞培养人视网膜血管内皮细胞（HRCECs）购自美国ScienCell公司。常规复苏HRCECs后用含10%胎牛血清的L-DMEM培养基培养，同时在培养液中添加青霉素（100 U∕mL）及链霉素（100 g∕L），培养条件为37℃恒温、5%体积分数二氧化碳的湿润培养箱。取第5代细胞用于实验。

1.3 CCK8法检测白花蛇舌草对高糖诱导的HRCECs增殖的影响取生长至对数期的第5代HRCECs，以5×104个∕毫升接种于96孔板，每孔200 μL，培养24 h后进行试验。对照组加入5.5 mmol∕L的葡萄糖；高渗对照组加19.5 mmol∕L的甘露醇及5.5 mmol∕L的葡萄糖；高糖对照组加入25 mmol∕L葡萄糖；白花蛇舌草组（HDI组）加入HDI（6.25 mL∕L、12.5 mL∕L、25 mL∕L、50 mL∕L）和25 mmol∕L的葡萄糖。HDI浓度的选择根据参考文献［7］和预实验结果进行筛选。每组设置5个重复孔，培养48 h后，弃掉已作用的培养液，每孔中加100 μL的新鲜培养基，同时在避光条件下加入CCK8 10 μL，避光孵育4 h，于450 nm波长，酶标仪测定吸光度值（OD值）。实验重复3次。

1.4 流式细胞术检测白花蛇舌草对高糖诱导的HRCECs周期的影响收集按照“1.2”分组处理48 h的各组细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，完全培养基终止消化，4℃离心（1 000 r∕min）5 min，弃掉上清，PBS洗涤细胞3次，离心。预冷无水乙醇悬浮沉淀，制备成为单细胞悬液，4℃固定过夜。检测前，PBS洗涤以除去固定液，加200 μL RNaseA（1 g∕L），于37℃水浴中30 min，然后加入1 mL碘化丙啶染色液，混匀，避光染色30 min，通过流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.5 流式细胞术检测白花蛇舌草对高糖诱导的HRCECs凋亡的影响收集按照“1.2”分组处理48 h的各组细胞，PBS洗涤细胞，用195 μL结合缓冲液重悬细胞，然后添加5 μL的碘化丙啶及5 μL的Annexin-FITC，混匀后，于室温条件下避光反应10 min。1 h内检测各组细胞凋亡率变化。实验重复3次。

1.6 激光扫描共聚焦显微镜检测白花蛇舌草对高糖诱导的HRCECs活性氧水平的影响使用二甲基亚砜溶解2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA），配置成1 mmol∕L的储备液，染色前使用PBS配置成浓度为10 μmol∕L的工作液。收集按照“1.2”分组处理48 h的各组细胞，吸弃培养液，预冷PBS洗涤细胞3次，滴加0.5 mL现配的H2DCFDA，37℃培养箱避光反应45 min，吸除染色液，PBS洗涤细胞3次，加入0.5 mL PBS。于488 nm激发波长，525 nm发射波长，激光扫描共聚焦显微镜检测各组细胞活性氧水平。实验重复3次。

1.7 蛋白质印迹法检测白花蛇舌草对高糖诱导的HRCECs PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3表达的影响收集按照“1.2”分组处理48 h的各组细胞，加适量含PMSF的细胞裂解液，于冰上反应30 min，4℃离心机离心15 min，收集上清。BCA法测定蛋白样品浓度。按照每孔30 μg上样蛋白，经SDS-PAGE电泳（90 V恒压）3 h，取出凝胶，通过电转PVDF膜（100 mA电流50 min），转好的膜至于5%脱脂奶粉中，室温孵育2 h，洗膜。将膜放置于经1∶500稀释的PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3抗体反应液中，室温孵育2 h，加1∶1 000稀释的HRP标记的二抗，室温反应2 h，ECL显色。采用Image J软件分析PVDF膜各条带灰度值。以灰度值目的蛋白∕灰度值GAPDH表示各蛋白的相对表达量。

1.8 统计学方法采用SPSS 21.0软件对所有实验数据进行分析，计量资料用±s表示，三组及三组以上差异比较采用单因素方差分析，两两比较采SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白花蛇舌草对高糖诱导的HRCECs增殖的影响采用CCK8法检测6.25 mL∕L、12.5 mL∕L、25 mL∕L和50 mL∕L的白花蛇舌草注射液对高糖诱导的HRCECs增殖的影响，见表1所示，与对照组比较，高糖组细胞活性明显升高（P＜0.05）。与高糖组比较，12.5 mL∕L、25 mL∕L和50 mL∕L的白花蛇舌草组细胞活性明显降低（P＜0.05）。6.25 mL∕L白花蛇舌草组细胞活性与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。选择50 mL∕L的白花蛇舌草作为研究对象。

表1 白花蛇舌草对高糖诱导的HRCECs增殖的影响

表1 白花蛇舌草对高糖诱导的HRCECs增殖的影响

注：HDI为白花蛇舌草注射液，OD为吸光度。①与对照组比较，P＜0.05。②与高糖组比较，P＜0.05。

组别对照组高糖组高渗对照组HDI组（6.25mL∕L）HDI组（12.5mL∕L）HDI组（25mL∕L）HDI组（50mL∕L）F值P值重复次数3 3 3 3 3 3 3 OD值0.684±0.072 1.116±0.105①0.889±0.092 1.101±0.087 0.847±0.076②0.639±0.058②0.421±0.042②31.01＜0.001

2.2 白花蛇舌草对高糖诱导的HRCECs周期的影响与对照组比较，高糖组G0∕G期细胞百分比明显升高，G2∕M期和S期细胞百分比明显降低（P＜0.05）。与高糖组比较，HDI组G0∕G期细胞百分比明显降低，G2∕M期和S期细胞百分比明显升高（P＜0.05）。见表2。

表2 白花蛇舌草对高糖诱导的HRCECs周期的影响

表2 白花蛇舌草对高糖诱导的HRCECs周期的影响

注：HDI为白花蛇舌草注射液。①与对照组比较，P＜0.05。②与高糖组比较，P＜0.05。

组别对照组高糖组高渗对照组HDI组F值P值重复次数3 3 3 3 G0∕G期54.72±4.31 60.02±5.01①56.59±4.88 32.31±3.42②24.03＜0.001 S期30.01±3.01 26.22±2.56①28.87±2.43 49.79±4.63②32.76＜0.001 G2∕M期15.27±1.11 13.76±1.23①14.54±0.96 17.90±1.54②6.42 0.016

2.3 白花蛇舌草对高糖诱导的HRCECs凋亡的影响对照组、高糖组、高渗对照组、HDI组的细胞凋亡率分别为（3.32±0.47）%、（17.11±1.01）%、（8.79±0.89）%、（9.72±0.73）%，四组凋亡率比较差异有统计学意义（F=150.33，P＜0.001）。与对照组比较，高糖组细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）。与高糖组比较，HDI组细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。见图1。

图1 流式细胞术检测白花蛇舌草对高糖诱导的HRCECs凋亡的影响

2.4 白花蛇舌草对高糖诱导的HRCECs活性氧水平的影响对照组、高糖组、高渗对照组、HDI组的荧 光 强 度 分 别 为42.14±3.56、96.18±5.22、75.59±5.13、67.75±4.83，四组荧光强度比较差异有统计学意义（F=66.86，P＜0.001）。与对照组比较，高糖组活性氧水平明显升高（P＜0.05），与高糖组比较，HDI组活性氧水平明显降低（P＜0.05）。

2.5 白花蛇舌草对高糖诱导的HRCECs PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3表达的影响与对照组比较，高糖组PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3表达均明显升高（P＜0.05），与高糖组比较，HDI组PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3表达均明显降低（P＜0.05）。见图2，表3。

表3 PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3蛋白相对表达量∕xˉ±s

图2 蛋白质印迹法检测PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3蛋白表达

3 讨论

DR严重危害病人的视功能，其特点是视网膜新生血管形成，目前其发病机制尚未完全明确［7］。白花蛇舌草是一种茜草科一年生草本植物，目前对DR HRCECs生长的影响尚未明确。本研究中CCK8结果显示，高糖可促进HRCECs增殖，12.5 mL∕L、25 mL∕L和50 mL∕L的 白 花 蛇 舌 草 对 高 糖 环 境 下HRCECs增殖具有抑制作用。这与既往研究结果一致［8］。由于50 mL∕L的白花蛇舌草对HRCECs增殖抑制更明显，因此选择作为研究对象。流式细胞仪结果显示，白花蛇舌草组S期细胞的数量明显增加，即白花蛇舌草可引起HRCECs发生S期阻滞。细胞的各个周期所调控的蛋白不同，在S期至G2∕M期过程中，CyclinA1发挥作用，其参与DNA合成、复制及细胞进入有丝分裂，是S期至G2∕M期过程的一个必须因子［9-10］。PCNA为细胞核内多聚酶辅助蛋白，其表达水平与细胞增殖存在正相关关系［11］。在细胞增殖过程中PCNA表达具有周期性，G0期PCNA基本上不表达，在G1晚期至S中期PCNA表达达到峰值，而在G2∕M期PCNA表达迅速下降，能准确地反映出细胞的生长状态及生长速度［12］。多项研究表明，高糖可影响PCNA和CyclinA1表达，而抑制其表达可减弱HRCECs增殖［13］。本研究结果显示，白花蛇舌草组S期PCNA及CyclinA1表达均明显降低。提示白花蛇舌草对HRCECs增殖调控与调节PCNA及CyclinA1表达有关。

氧化应激是指机体内活性氧、活性氮类自由基（RNS）等高活性分子产生过多，消除降低，最终导致细胞内酶及蛋白变性，生物膜脂质的过氧化，DNA损害，引起细胞发生凋亡或死亡，进而引起组织受损［14-15］。异常代谢可引起血糖升高，而活性氧累积所造成的氧化应激可损害视网膜血管，最终导致DR的发生［16-17］。众所周知，氧化应激激活caspase级联反应是其引起细胞凋亡的重要途径［18］。caspase-3是caspase家族成员关键酶，也是执行凋亡的最主要因子，其激活可使凋亡不可逆［19］。多项研究表明，高糖可引起细胞的氧化应激，诱导细胞凋亡及caspase-3的表达，而抑制氧化应激及凋亡对细胞损伤具有保护作用［20-21］。白花蛇舌草是否可影响高糖诱导的HRCECs凋亡及氧化应激还未明确。本研究结果显示，高糖可引起HRCECs凋亡增加，活性氧水平增加，cleaved caspase-3表达增加，而白花蛇舌草可减弱高糖对HRCECs凋亡、活性氧水平及cleaved caspase-3表达影响。提示白花蛇舌草可通过降低HRCECs凋亡及活性氧水平而减弱高糖引起的细胞损伤。

综上所述，白花蛇舌草可减弱高糖对细胞增殖、周期、凋亡、活性氧水平及PCNA、CyclinA1和cleaved caspase-3表达影响。提示白花蛇舌草对DR具有潜在保护和治疗作用，但还需更多研究证实。