孕妇外周血微小RNA异常表达谱的鉴定及对妊娠期糖尿病的诊断价值研究

钟新丽，何秋，朱红霞

在过去的20年里，妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）在中国人口中的发病率已经上升至17.5%～18.9%，成为一个重要的公共卫生问题［1］。GDM会对胎儿及其母亲造成长期的健康损伤［2］，据报道，患有GDM的孕妇易患先兆子痫，高达70%的GDM妇女会在分娩后发生2型糖尿病和心血管疾病［3］。GDM的发病机制复杂且未完全阐明［4］。最近的研究表明，孕妇外周血中miRNAs的异常表达与GDM的发生有关，但关于特异性miRNAs种类尚未达成一致［5］。miRNAs既存在于细胞质中，也存在于细胞外基质中［6］。虽然外周血miRNAs的确切效应尚不清楚，但有研究者发现，胎盘分泌miRNAs前体进入外周血液，由于miRNAs在体液中高度稳定，因此，外周血miRNAs可作为多种疾病的候选生物标志物［7］。目前，GDM的诊断依赖于口服葡萄糖耐量试验（OGTT），但此项检查流程较多，需要禁食和多次抽血，恶心和呕吐等不良反应也会导致病人依从性下降［8］。因此，寻找新的GDM生物标志物，可能为GDM的早期诊断和辅助诊断提供线索［9］。在本研究中，我们鉴定了GDM病人外周血中差异表达的miRNAs，评估验证了miRNAs的靶基因与代谢途径和生物学过程之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2018年1月至2020年2月成都市双流区第一人民医院收治的62例妊娠晚期（妊娠26～40周）糖尿病病人为研究对象（GDM组）。纳入标准：（1）年龄范围24～40岁。（2）单胎妊娠。（3）均经OGTT试验确诊为GDM。（4）首次妊娠。（5）孕妇及其近亲属对本研究知情同意。排除标准：（1）孕前糖尿病、高血压病人。（2）多胎妊娠。（3）合并先兆早产、早产、胎儿生长受限、前置胎盘和其他妊娠相关并发症。（4）临床资料不完全。同时，选择同期我院收治的年龄匹配、糖耐量正常的62例孕妇为糖耐量正常（NGT）组。GDM组给予饮食和运动疗法，血糖高于目标值者，皮下注射胰岛素，直至血糖恢复正常，血糖控制目标为空腹血糖＜5.3 mmol∕L，餐后1 h血糖＜7.8 mmol∕L，餐后2 h血糖＜6.7 mmol∕L。所有孕妇均抽取静脉血5 mL，轻轻将全血滴入洁净的EP管，4℃下静置4 h。在4 000 g、4℃条件下离心10 min，上层为淡黄色血清，吸出上清后再在1 500 g、4℃条件下离心10 min，以最大程度保证血清质量，分装血清，冻存于-80℃冰箱。所有收获的血液样品均在-80℃下超低温保存。本研究使用的临床资料来自门诊和住院病历。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，病人或近亲属对研究方案签署知情同意书。

1.2 最新高通量测序检测使用NanoPhotometer®分光光度计、Qubit®2.0荧光光度计和Agilent 2100 RNA Nano 6000分析试剂盒从 等GDM组 和NGT组孕妇外周血中提取总RNA。使用NextSeq测序平台上的SE50测序程序对合格的DNA文库进行测序，以获得高质量的序列读数。通过Bowtie对数据进行清理并与参考基因组进行比对，并使用miRDeep2软件鉴定miRNAs。DESeq分析得到差异表达的miRNAs，筛选标准为Q＜0.05，|log2foldYchange|＞1。

1.3 RNA提取及RT-PCR检测根据制造商的说明，提取总外周血RNA。互补脱氧核糖核酸是用MMul V逆 转 录 酶 在 凸 环miRNA-144∕125b∕543∕15b∕451∕U6 miRNA RT引物（中国广东广州RiboBio）的作用下合成的。定量聚合酶链反应（QPCR）使用SYBR试剂在CFX96实时PCR检测系统上进行，PCR反应重复三次。PCR反应条件为95℃变性20 s，然后95℃变性10 s，60℃变性20 s，70℃变性10 s，共40个循环。用U6对qPCR数据进行归一化处理。

1.4 统计学方法使用SPSS 22.0软件包和Weka 3.6数据挖掘软件包进行统计分析。计量资料采用单样本Kolmogorov-Smirnov法检验数据是否符合正态性，正态分布的数据用±s表示，采用t检验。计数资料用例数表示，采用χ2检验。采用逐步logistic回归多因素分析筛选孕期血糖水平升高的因素。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 妊娠期糖尿病病人外周血中miRNAs的差异表达与NGT组相比，GDM组孕妇外周血共检测到157个差异表达的miRNAs，其中114个上调，43个下调（图1a）。层级聚类（图1b）显示GDM组与NGT组的miRNA图谱明显不同，其中8个miRNAs显著上调，6个miRNAs下调（P＜0.05）。

2.2 妊娠期糖尿病和非妊娠期糖尿病病人外周血中差异表达miRNAs的验证利用qPCR验证在外周血中高表达且最可能与能量代谢相关的差异表达的miRNAs。选取5个miRNAs，即miRNA125b、miRNA-543、miRNA-144、miRNA-15b和miRNA-451在GDM组和NGT组孕妇外周血组织中进行qPCR验证。qPCR结果显 示，NGT组、GDM组miRNA-125b的相对表达水平分别为5.83±1.31、1.34±0.30（t=26.31，P＜0.001），miRNA-543的相对表达水平分别为0.93±0.21、0.22±0.06（t=25.60，P＜0.001），miRNA-144的相对表达水平分别为0.42±0.19、1.32±0.28（t=20.94，P＜0.001），miRNA-125b、miRNA-543和miRNA-144的表达水平与最新高通量测序结果一致（P＜0.05）。两组间miRNA-15b和miRNA-451的表达水平差异无统计学意义。

2.3 miRNA-125b和miRNA-144在外周血中的表达应用qPCR技术检测GDM组和NGT组孕妇血浆中miRNA-144和miRNA-125b的表达水平。糖化血红蛋白（HbA1c）和血糖水平，在所有三个时间点，GDM组均显著高于NGT组（P=0.499）。与NGT组相比，GDM组孕前体质量明显增加，体质量指数（BMI）、分娩前舒张压、血小板水平明显升高。与非妊娠期糖尿病孕妇相比，妊娠期糖尿病孕妇外周血中miRNA-125b表达下调（P＜0.001），miRNA-144表达上调（P＜0.001）。表1。

表1 两组孕妇临床特征比较

表1 两组孕妇临床特征比较

注：OGTT为口服葡萄糖耐量试验，HbA1c为糖化血红蛋白，BMI为体质量指数。

指标OGTT 0 h∕（mmol∕L）OGTT 1 h∕（mmol∕L）OGTT 2 h∕（mmol∕L）HbA1C∕%年龄∕岁分娩时的妊娠时间∕d体质量∕kg孕期体质量增加∕kg孕前BMI∕（kg∕m2）孕期BMI增加∕（kg∕m2）收缩压∕mmHg舒张压∕mmHg白细胞计数∕（×109∕L）淋巴细胞百分比∕%中性粒细胞∕淋巴细胞比血红蛋白∕（g∕L）血小板计数∕（×109∕L）腹围∕cm新生儿体质量∕g miRNA-125b miRNA-144 NGT组（n=62）4.46±0.40 6.76±2.54 5.79±1.12 5.13±0.36 30.54±5.74 277.98±9.63 58.76±11.25 16.52±4.43 22.32±3.84 6.28±1.83 125.36±9.25 77.52±5.63 9.46±2.33 20.65±5.24 4.35±3.56 115.63±12.84 242.64±53.14 104.65±8.36 3 418.99±436.25 2.38±1.26 0.73±0.46 GDM组（n=62）5.23±0.59 11.20±1.42 9.23±1.84 5.69±0.53 32.54±4.78 279.65±10.52 65.87±11.02 14.23±5.11 25.14±4.23 5.95±1.76 128.65±10.32 84.32±8.93 8.94±2.24 19.65±5.00 4.49±3.02 114.88±13.04 213.52±48.79 105.68±7.74 3 769.36±536.22 0.54±0.79 2.98±1.35 t值-8.51-12.01-12.57-6.88-2.11-0.92-3.55 2.67-3.89 1.02-1.87-5.07 1.27 1.09-0.24 0.32 3.18-0.71 30.18 9.74-12.42 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.037 0.358 0.001 0.009＜0.001 0.308 0.064＜0.001 0.208 0.279 0.814 0.747 0.002 0.478＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 miRNA-144、miRNA-125b与临床参数的相关性在妊娠期间（r=-0.33，P=0.018）和分娩前（r=-0.29，P=0.039），miRNA144的表达与BMI呈负相关，而与血小板数量（r=0.31，P=0.028）和餐后1 h血糖水平呈正相关（r=0.28、P=0.044）。miRNA-125b与妊娠期糖尿病呈负相关（r=-0.91，P＜0.001），而miRNA-144和孕前BMI与妊娠期糖尿病呈正相关（r=0.89、0.30，P＜0.001，P=0.033）。图2。

图2 miRNA-144、miRNA-125b与妊娠期糖尿病临床参数的相关性

2.5 影响GDM发病的危险因素分析多因素分析结果显示，miRNA-125b、miRNA-144和孕前BMI是影 响GDM发 病 的 独 立 性 危 险 因 素（P＜0.05）。见表2。

表2 影响妊娠期糖尿病发生的危险因素分析

3 讨论

在本研究中，我们发现miRNA-125b和miRNA-144在外周血大量表达，且二者是影响GDM发病的独立性危险因素。GDM孕妇外周血中miRNA-125b和miRNA-144明显改变，可作为妊娠期糖尿病的潜在生物标志物。此外，与研究报告一致的是，BMI高的肥胖女性患妊娠期糖尿病的风险明显更高，孕前BMI是一个容易测量的临床因素，与妊娠期糖尿病的发病率呈正相关［10］。

miRNA-125b是miRNA-125家族的成员。miRNA-125不是孕妇外周血特异性miRNA，胰腺和中枢神经细胞中的β细胞也分泌miRNA-125［11］。有研究表明，妊娠期miRNA-125水平明显升高。在本研究中，我们还发现miRNA-125b在外周血中高表达。然而，研究发现妊娠晚期GDM病人血清miRNA-125水平无明显差异，这与本研究结果不一致。这可能是由于病人特征、实验方法和组织的不同造成的。有研究者发现，与健康人相比，2型糖尿病病人和肥胖男性病人外周血中miRNA-125b的水平显著降低，这与本研究的结果一致，其中，我们发现miRNA-125b的表达下降与GDM发病显著相关［12］。最近的研究表明，miRNA-125b的低表达可能通过增加c-maf转录本的表达而促进高血糖［13］，并抑制人去乙酰化酶Sirtuin-7的表达。研究结果提示，miRNA-125b的低水平表达与糖代谢异常有关。本研究的靶基因功能富集分析结果表明，miRNA-125b可能通过能量代谢途径影响血糖代谢。

以往的研究发现，miRNA-144在糖尿病病人血液中表达上调，并且在1型、2型糖尿病和妊娠期糖尿病病人中表达失调［14］。我们的研究还表明，在妊娠晚期，妊娠期糖尿病病人血浆外切体中miRNA-144的表达显著增加。miRNA-144直接靶向胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate，IRS1）和葡萄糖转运体（glucose Transporters，GLUT）［15］。IRS1高度参与胰岛素信号转导通路，GLUT也可能调节葡萄糖代谢［16］。然而，基于同一队列的两项研究表明miRNA-144与血糖水平呈负相关。有研究者发现妊娠期糖尿病病人胎盘绒毛分泌的外体miRNA-144表达降低［17］。此外，尽管妊娠期糖尿病组孕妇在怀孕前和分娩前表现出更高的miRNA-144和BMI水平，但在本研究中，这两个参数与妊娠期糖尿病的发病率呈显著负相关。miRNA-144的异常表达与糖脂代谢密切相关，但从现有文献中得出的结论是相互矛盾的，可能是由于种族、性别、实验方法和样本量的差异［18］。能量代谢与年龄、性别、BMI和不同的身体组织有关，因此其作用机制往往非常复杂［19］。miRNA-144在妊娠期糖尿病发病机制中的作用机制尚需进一步研究。

综上所述，本研究发现了新的妊娠期糖尿病生物标志物，为妊娠期糖尿病的诊断方法和发病机制的研究提供了新的思路。但也存在一定的缺陷：（1）缺少随访研究来证实miRNA-125b和miRNA-144对妊娠早期和中期妊娠期糖尿病发病率的预测价值；（2）本研究采用病例对照研究方法，但由于妊娠期糖尿病的影响，两组孕妇在体质量、BMI等基线资料方面不可避免地存在一定的差异；（3）样本量较少，且来自于单中心，可能存在一定的样本偏倚。

（本文图1见插图1-4）