三系杂交小麦混播制种对杂交种产量、纯度及F1产量优势的影响

孔德真 聂迎彬 徐红军 崔凤娟 穆培源 田笑明

（新疆农垦科学院作物研究所/谷物品质与遗传改良兵团重点实验室，石河子 832000）

杂种优势是自然界普遍存在的一种生物现象。三大主要粮食作物中，小麦杂种优势利用还未在生产上大规模应用［1］。杂交小麦不仅在产量方面表现出优良的特性，还在籽粒和秸秆品质、抗逆性以及小麦灌浆速率等方面均优于双亲或对照小麦普通品种［2-3］。目前，在强优势杂交组合选配方面取得了较大进展，二系杂交小麦中约1/10的组合超亲优势在20%以上［4］，云杂3号在生产示范中杂种优势为11.4%-21.9%［5］；三系杂交小麦新冬43号在生产试验中，较对照增产10.55%［6］。但是，杂交小麦制种成本高、杂交种的质量是制约杂交种大面积推广的主要因素。目前，杂交小麦种子生产成本是常规小麦种子生产成本的2-3倍。如何提高小麦杂交种的生产效率，降低生产成本是亟需解决的问题。

混播制种将原有的制种程序简化，使杂交小麦种子生产更加经济高效［7］。通过对父、母本混播比例的研究发现，20∶80的混播制种产量高于50∶50行比制种，在父本混播比例从20%提高到35%或50% 时产量没有明显提高［8］。Koekemoer等［9］研究发现，混播制种比（20∶80）-（50∶50）的行比制种产量可增加46%-76%。混播制种由于杂交组合的不同，父本混掺比例对制种产量和纯度有较大影响［10］。上述仅研究了单一增加父本比例对制种产量的影响，未对混播混收对制种产量和种子纯度的变化进行研究。

SSR分子标记已经成功运用于小麦种子DUS检测［11］，可进行多个小麦品种纯度的检测。Tiwari等［12］选用40个小麦杂交种和14个亲本选用20个SSR分子标记，有8个标记在杂交种中表现出多态显性位点。由此看出，SSR分子标记对杂交小麦杂交种和亲本区分是有效的。小麦AL型不育细胞质来自普通小麦（Triticum aestivum L.）的变种（Alborubrum Korn）辉县红，AL取自变种拉丁名的两首字母大写。该不育系具有易恢复、无不良细胞质效应等特点。为此，开展AL型不育系混播制种和开发一套AL型三系杂交小麦杂交种纯度SSR分子标记检测方法是十分必要的。

与其它制种模式相比，混播制种具有容易实现大面积种子生产和较低制种成本，成为杂交小麦制种的首选模式［1］。但是，对异交结实不同的强优势杂交小麦组合进行混播制种及相应种子纯度检验研究报道较少。本研究采用3个异交结实率不同的强优势杂交组合，对隔离条件下混播制种、杂交种纯度，以及种植不同混播比例混收的F1杂交种产量变化进行了研究。旨在为建立一套高效、经济的杂交小麦制种新体系，促进三系杂交小麦商业化应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料由新疆农垦科学院作物研究所小麦创新团队提供。组合1：垦冬杂43（36A×2014AR5），不育系36A连续5年测定自然异交结实率平均为90%，株高比恢复系低6 cm；组合2：垦冬杂22（002A×99AR142-1），不育系002A连续4年测定自然异交结实率平均为63%，不育系穗颖壳白色，恢复系穗颖壳红色，株高比恢复系低9 cm。组合新冬43号（18A×99AR144-1，2013年新疆维吾尔自治区审定命名），不育系18A连续3年测定自然异交结实率平均为73%，用于AL型三系杂交小麦种子纯度分子标记检测方程的建立。所有试验材料的不育系和恢复系都由作物研究所小麦创新团队自主选育。

1.2 方法

1.2.1 试验地点和时间 试验在新疆农垦科学院作物研究所科学试验田内进行，分别对组合1和组合2在2018年和2019年9月按不同比例进行混播，第2年5月15日左右抽穗后给混播制种小区搭建全封闭隔离区（1.5 m高框架，400目尼纶网罩）。恢复系扬花期，采用电动吹风机在上午11点和下午17点分别人工辅助授粉一次，连续赶粉7 d左右。6月5日左右拆除制种小区隔离罩。全生育期水肥管理同大田保持一致。

1.2.2 混播制种田间种植方案 混播制种组合1和组合2采用5个小区制种处理，父本恢复系种子按照母本不育系种子粒数的3%、6%、9%、12%、15%的比例均匀混入不育系种子中，以父、母本3∶9行比制种作为对照小区，各小区制种面积为9.45 m2。每个混播制种小区种植18行，每行67粒，行长1.8 m，行距为0.25 m，成熟后混合收获。行比制种小区为21行，中间3行播恢复系，两边各播9行不育系，成熟后仅收获18行不育系上所结种子。

1.2.3 混播制种田间纯度检测方法 根据组合2恢复系成熟后颖壳为红色的性状特征，成熟后分别收获和统计每个处理小区父本和母本的收获穗数，计算制种区（F0）田间纯度（F0田间纯度%＝♀收获穗÷田间总收获穗数×100%）。然后分别脱粒母本穗异交（F1）和父本穗自交的收获穗数和产量。

1.2.4 混播制种生产的杂交种产量测定 组合1和组合2各混播制种处理生产的杂交种和行比对照生产的杂交种进行田间产量比较。试验采用随机区组设计，每个处理6行，行距0.25 m，每行40粒，小区面积2.7 m2，2次重复。小麦成熟期，分别人工收割、脱粒，自然风干后测定产量。

1.2.5 杂交种分子标记纯度检测方法 以抽取纯度100%的杂交小麦新冬43号种子1 400粒，等分成14份，每份100粒。其中7份人工混合恢复系种子，不同种子纯度比例设计如下：100%，97%，94%，91%，88%，85%和82%，见表1。每种比例用四分法随机抽取25粒种子，在穴盘上发苗，采用CTAB法［13］提取叶片DNA。利用本研究团队前期开发的恢复基因（qRf-2A-1）连锁的SSR分子标记Wmc474［14］对幼苗DAN进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳染色检测［15］，分别统计各试验处理杂交种和非杂交种子的检测数量；将统计出的检测值与设计理论值作相关性分析和回归分析得到小麦杂交种纯度计算值与检测值方程。

表1 人为混入恢复系试验设计Table 1 Artificial blended restorer line test design

1.2.6 产量表型数据获取 组合2在小麦出苗期和收获期统计每个混播制种小区的基本苗和总收获穗数。根据父本颖壳标记性状区分不同混播比例下父本收获穗数、母本收获穗数，田间总收获穗数，分区分别人工收割父本和母本穗、脱粒，自然风干后称籽粒重，然后称取籽粒千粒重（2份取平均值）。F1种子纯度（%）=（母本收获粒数÷收获总粒数）×100%。

1.2.7 数据处理 所有数据采用SPSS17.0的多重比较法（LSD法）进行统计分析和差异显著性检验（P＜0.05）。用Microsoft Excel 2010软件进行数据统计和作图。

2 结果

2.1 混播不同比例恢复系对制种产量的影响

不同父本混播比例对小区混收制种产量有较大的影响。由表2可以看出，与对照相比不同混播比例随着恢复系种子混掺比例逐渐增多，小区混收种子产量（含父本产量）表现出逐渐增加的趋势。与行比制种对照相比，在混播比例为9%时，混播混收杂交制种产量达到2 037.98 g，与对照相比增产58.1%。随着混播比例增大，杂交种产量占小区混收种子产量的比例逐渐减小，在混播恢复系比例为15%时，杂交种产量占小区混收种子产量比率为78.74%。在混播混收制种过程中，为使制种产量及种子纯度均达到较高要求，组合1选用混掺6%的恢复系种子制种，混播混收制种产量较对照增产26.86%，杂种种子产量占比可达到89.07%。组合2的父本穗颖壳为红色，与不育系穗颖壳白色可以明显区别，分别统计父本和母本收获穗数，可以精确估计制种小区（F0）田间种植纯度与杂种种子产量。

表2 组合1混播不同比例恢复系对混播混收制种产量的影响（2018年）Table 2 Effects of different mixed sowing ratios of male parents in combination 1 on the yield of seed production via mixed sowing and mixed harvesting（2018）

由表3可以看出，组合2在混播不同比例恢复系种子制种中，制种小区（F0）的田间种植纯度随着混播比例的增大而减小，父本穗所占比率与设计混播比例的差异受田间出苗率的影响，也与恢复系成穗率较不育系低有关。当父本的混掺比例为12%时，混播混收制种小区田间纯度为94.08%，杂交种的制种产量达到291.1 g，与对照相比增产146.7%。比较组合1与组合2制种产量的差异显然与2个不育系的异交结实率相差近30%有密切关系。说明不育系的异交结实率是影响制种产量非常重要的因素。

由于制种试验是在封闭隔离小区中进行，2个不育

系在授粉期对隔离小区内部高温的耐受力有差异，

也是导致2年之间两个组合制种收获产量差异较大

的原因。

2.2 组合2混播比例对种子纯度和产量的关系分析

由于全封闭隔离区小气候原因，组合2不育系

异交结实率（平均3.58%，穗粒数5.74粒）显著低

于自然条件下异交结实率（平均63%，穗粒数24粒），

抽穗后的隔离环境对成穗数没有影响，籽粒形成期

撤除隔离罩对千粒重影响不大（表3）。因此，用隔

表3 组合2不同混播恢复系比例对杂交种制种产量的影响（2019年）Table 3 Effects of mixing ratio of male and female parents on the seed production yield of hybrid line in combination 2 （2019）

离条件下组合2不育系收获穗数和千粒重与自然条件下不育系异交穗粒数模拟分析不同混播比例对产量和纯度的影响（表4，图1）。从图1可以看出，混播混收制种与行比制种对照（CK）比较皆增产，种子纯度随混播比例增加逐渐降低，当混播比例为5%时，制种产量3.84 kg较对照3.63 kg增产5.78%，杂交种的纯度为96.45%。目前，国家对杂交小麦种子纯度没有相关标准，参考杂交水稻和杂交玉米大田杂交种纯度不低于96%的国家标准，组合2选用混播恢复系3%-5%时，杂交种的纯度都可达到96%以上，但考虑制种产量，混播恢复系比例为5%时，制种产量和纯度最佳。

图1 不同混播比例对制种纯度和产量的影响Fig.1 Influence of different blending ratio on seed production purity and yield

表4 组合2不育系按60%自然异交率和试验收获穗数测算制种纯度和制种产量Table 4 Seed production purity and seed yield of the sterile line of combination 2 calculated based on the 60%natural outcrossing rate and the number of ears harvested in the experiment

2.3 不同混播比例的F1代产量比较

由图2可以看出，2个杂交组合不同混播比例制种的F1产量较对照（行比制种）均有不同程度的提高。随着混播比例的增大，杂交种的产量表现出先增大后减小的趋势。组合1恢复系混播比例在12%时F1杂交种产量较对照增产6.49%，但未达到显著水平；组合2在混播比例为9%时的F1杂交种产量最高，与对照比较增产33.2%达到显著水平，其余混播比例的F1产量与对照比较未达到显著水平；表明混播制种的F1代产量与对照比较没有降低，甚至具有不同程度的提高。

图2 不同混播比例对杂种优势的影响Fig.2 Effects of different mixing ratio on heterosis

2.4 杂交种混杂不同比例恢复系种子SSR分子标记纯度检测

课题组前期采用复合区间作图法在1BS染色体上检测到与恢复基因相关的1个QTL 位点（qRf-1B-1），该QTL位点距离两端连锁SSR标记为Xbarc8和Xgwm413之间，2A染色体上与恢复基因相关的QTL位点位（qRf-2A-1）于Wmc474和Wmc198之间。利用恢复基因差异位点的SSR分子标记可进行恢复基因的分子标记辅助选择，还可应用于AL型杂交小麦杂交种子纯度检验［16］，加快杂交种纯度检测的速度。按表1的试验设计和检测方法，应用2A染色体上恢复基因的SSR分子标记Wmc474对新冬43号杂交种混杂不同比例恢复系种子分子标记纯度检测结果列表5。其中对混入12%恢复系种子（25粒被测种子中恢复系理论粒数为3粒）的电泳检测如图3所示，1号为杂交种杂合泳带，2号为恢复系泳带，9号、15号、25号3条泳带为恢复系带型，其余带型为杂合带型，将检测结果x=3代入表5纯度检测回归方程y=0.285 7+1.142 8x，y=3.71，1-（3.71÷25）×100得到85.16%检测纯度与表5所示理论纯度88%结果基本一致。

图3 采用Wmc474引物检测混掺6%恢复系电泳图Fig.3 Electrophoretic diagram of blend 6% restorer line detected by Wmc474 primer

表5 杂交种混杂不同比例恢复系种子分子标记纯度分析Table 5 Molecular marker purity analysis of restorer mixed with different proportions of hybrid seeds

为验证2个分子标记检测结果的实用性，我们在隔离区，将新冬43号杂交种子与恢复系99AR144-1种子按85%∶15%比例混合播种。从收获的种子中随机抽取1 000粒种子，再用四分法随机取25粒种子发苗，提取叶片DNA，利用前期1B染色体上与恢复基因连锁的SSR分子标记XBarc8建立的回归方程［17］进行了验证，将检测结果x=3代入引物XBarc8纯度检测回归方程y=-0.145 2+0.931 4x，y=2.79，1-（2.79÷25）×100%得到88.84%，检测纯度与理论纯度85%结果基本一致；表明用2个分子标记建立的2个回归方程在混播恢复系制种的纯度鉴别中均可使用。

3 讨论

小麦杂交种制种产量和成本是制约杂交小麦大面积应用的主要因素。因此，建立一种简易、高效、低成本的制种体系对于杂交小麦大面积推广具有重要意义。混播混收制种可以使恢复系植株均匀的分布于不育系群体中，减小了小麦花粉在异交过程中的移动距离，增大了母本授粉概率，可以提高母本的异交结实率。宋喜悦等［10］研究发现，在父本0.5 m范围内，母本异交结实率可达80%-90%，而距父本2-2.5 m范围的母本异交结实率仅为30%-40%；龚德平等［18］采用混播混收制种方法对10个强优势杂交组合进行混播制种研究，各组合混播混收制种产量均高于分播制种，平均增产幅度达到了13.4%。Whitford等［19］研究发现，在混播制种条件下，父本混播比率从20%增加到50%，制种产量从46%增加到76%。

上述仅研究了单一增加父本比例对制种产量的影响，未对混播混收对制种产量和种子纯度的变化进行研究。我们的研究表明，不育系混播恢复系制种作为杂交小麦制种的一种方法，由于不同杂交组合之间母本的异交结实率存在较大差异，不同混播比例对产量和纯度都有较大的影响。在混播混收制种过程中父本混播比例逐渐增大，母本结实率逐渐提高，混收种子产量逐渐增加，种子纯度逐渐降低；在保证种子产量和纯度的前提下，合理确定父、母本混播比例，将制种产量和纯度达到最佳是至关重要的［1］。目前，国家对杂交小麦大田生产用种纯度没有相关标准，杂交水稻和杂交玉米大田用种国家标准为杂交种纯度不低于96%（GB4404.1-2008）。本研究以此为参考，当不育系的自然异交结实率大于60%，父本恢复系的混播比例在3%-5%时杂交种纯度大于96%，制种产量也高于行比制种，在生产中优选推荐5%为父本的混播比例。杂交种的产量不仅与制种方式有关还与母本不育系的异交特性密切相关。要选择不育系柱头外露率高、柱头生活力强，株高较父本低10 cm以上，恢复系主要选择花药外露率高、散粉好、花期较长、株高比对应的母本高10 cm以上，可以显著提高母本的异交结实率。

在杂交小麦种子生产过程中，杂交种纯度检测由传统方法向分子标记指纹图谱方法转变。应用分子标记构建指纹图谱筛选品种间的特异带谱，为种子纯度鉴定提供了一种更准确的方法［20］。本研究采用2A染色体上与恢复系基因连锁的SSR标记Wmc474标记建立了纯度检测回归方程，与在同一恢复系1B染色体上Xbarc8为标记建立的回归方程y=-0.1452+0.9314x，r=0.9875**［15］相比较，两个不同染色体上的恢复基因相关标记可以比较准确地对AL型杂交种纯度进行检测。

在混播混收制种过程中，收获杂交种中混入了少量恢复系，对产量优势及群体变化产生不同的影响。杂交种与父本恢复系在株高、叶型等多个农艺性状之间存在差异，相当于两个不同品种之间的混合播种。通过研究发现，具有不同形态、生理特征的小麦品种在单一种植条件下，往往出现病害、冻害等现象，从而影响产量。而不同品种混播能够比较充分地利用光、温、水、气等自然资源，提高群体的稳定性和安全性［21］，宋喜悦等［10］对混入不同比例恢复系进行制种并对杂交种的杂种优势进行研究发现在混合比例为17∶3（混入比例为15%）时，产量优势达到最大，这与本研究在12%时杂交组合产量优势较高的结果相近，但是他没有考虑杂交种子纯度下降的因素。混播混收制种生产的杂交种中混入部分父本可能导致F1代群体成熟期不一致，收获时不能在最佳成熟期收获。因此，针对杂交小麦混播混收制种强优势杂交组合亲本的选育，不仅需要在杂交制种产量和F1代产量上表现出较强的优势，还需要注意选择双亲在成熟期、株高基本一致，为F1田间表现的一致性和最佳收获提供保障。杂交小麦混播混收制种不会因为父本恢复系混入而导致杂种优势降低。说明科学合理的混播混收制种技术可简化杂交小麦的制种程序，降低制种成本，在保证生产用种子纯度标准的前提下提高制种产量，有利于杂交小麦的生产应用。

4 结论

在杂交小麦混播混收制种过程中，杂交组合母本异交结实率为63%-90%时，父本最佳混入比例分别为3%-5%，杂交种种子纯度和产量均达到最佳。混入父本的比例随着母本的异交结实率逐渐增大而减小；在不同混播比例条件下制种的F1代杂交种产量与对照比较没有降低，甚至具有不同程度的提高；2个与AL型不育恢复基因连锁的SSR分子标记可以比较准确地检测混播混收制种产生的杂交种种子纯度。