一株安全高效的好氧反硝化菌Pseudomonas stutzeri DZ11的生物安全性及脱氮性能研究

赵洋 孙慧明 林浩澎 罗娉婷 朱雅婷 陈琼华 舒琥

（广州大学生命科学学院，广州 510006）

中国是世界上主要的水产养殖大国，在水产养殖业蓬勃发展的同时也带来了大量的水污染。水产养殖废水属污染成分简单的低浓度有机污水，主要污染物有氨氮、亚硝酸盐、有机污染物等。根据2020年生态环境部发布的《第二次全国污染源普查公报》表明我国水产养殖业每年排放的养殖废水中含有氨氮 22 300 t，总氮 99 100 t，总磷 16 100 t［1］。如何安全，高效的处理这些养殖废水成为目前一大难题。

生物脱氮因其具有安全、经济、高效等优点被视为目前最有发展前景的技术之一［2］。生物脱氮的反应类型主要有两种，分别为硝化反应和反硝化反应。传统的生物脱氮如SHARON 工艺（短程硝化反硝化工艺），ANAMMOX 工艺（厌氧氨氧化工艺）等都将好氧硝化和厌氧反硝化分为相对独立的两步，硝化反应速度慢，同时还要严格控制温度、pH以及氮素含量的影响，增加了成本和管理难度。近年来，好氧反硝化菌因其同时具有异养硝化和好氧反硝化能力开始受到广泛的关注。国内外研究者在海水沉积物，含水层介质，土壤，水库沉积物，养殖废水等样品中都发现和筛选出来多种好氧反硝化菌［3-8］。其中李文甫等［6］在养殖废水分离出的假单胞菌属（Pseudomonas sp.）亚硝态氮去除率为99.10%，氨氮去除率为93.92%，朱晓明等［5］在含水层介质分离出来的假单胞菌属恶臭假单胞菌（Pseudomonas Putida）硝酸盐去除率为95.3%，氨氮去除率为98.5%，证明这类菌株具有高效的脱氮作用。

目前的研究大多集中在分离鉴定和初步的脱氮性能方面，却忽略菌株的安全性。陈军昌等［9］发现仅注射1.0×106CFU/mL腐败假单胞菌悬液5 μL便可使稚蟹3 h内死亡。假单胞菌属中常见的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种重要的革兰氏阴性条件致病菌，可引发人体呼吸道、泌尿道、皮肤软组织及手术创面等多部位的急性或慢性感染［10］。菌株的生物安全性评估是把一个微生物菌株引入到另外一个环境中的非常重要环节［11］。病原微生物的引入不仅有可能破坏自然环境中原有菌群的平衡而且对人类的健康生存存在重大的安全隐患，所以对实验菌株进行生物毒性和生物安全性探究至关重要。

本实验对从养殖废水和底泥中筛选出来的好氧反硝化菌进行研究，对该菌开展形态学观察、生理生化特性和16S rDNA基因序列分析，通过药敏性实验和生物安全性分析，探究不同反应条件对其脱氮性能的影响，以期获得更有利于实际应用养殖尾水处理的安全高效菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 中山市民众镇水产养殖场底泥及污水中筛选出来的菌株。用甘油冷冻法保存在实验室，使用前富集培养。

1.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，KNO31 g，NaCl 5 g，琼脂 20 g，pH 7.2-7.4；DM发酵培养基（g/L）KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，Na2HPO47.9 g，柠檬酸钠5.66 g，微量元素溶液 2 mL，NH4Cl 0.026 75 g（或NaNO30.04 g或 NaNO20.345 g），pH 7.2。微量元素溶液（g/L）：EDTA 50.0 g，ZnSO4·7H2O 2.2 g，CaCl25.5 g，MnCl2·4H2O 5.06 g，FeSO45.0 g，CuSO4·5H2O 1.57 g，CoCl2·6H2O 1.60 g。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定 将菌株DZ11于牛肉膏蛋白胨培养基28℃培养24 h，观察菌落形态。通过扫描电镜观察分离菌株的个体形态。生理生化特性依据《伯杰细菌鉴定手册》 进行鉴定。

1.2.2 16 S rDNA测序及系统发育树构建 使用上海生工有限公司购买的DNA提取试剂盒提取DZ11的DNA并以其为模板，采用细菌通用性正向引物（27F）和反向引物（1492R）进行扩增，琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。扩增产物送上海生工有限公司进行测序。获得的序列在NCBI的 GenBank 数据库进行Blast同源性对比，并使用 MEGA 7.0 软件采用 N-J法构建系统发育树。

1.2.3 菌株的药敏试验 取在营养肉汤中培养了18 h的菌液200 mL，均匀涂布在营养琼脂表面。平板放置15-20 min后，用无菌镊子取药敏纸片，贴于平板表面，并轻压纸片，设置2个平行，置于28℃培养18 h。使用游标卡尺测量抑菌圈大小，并做好记录。结果判断参照SN/T 1944-2016 《动物及其制品中细菌耐药性的测定—纸片扩散法》［12-13］。

1.2.4 生物安全性检测 选取健康并且活力好的斑马鱼（体长4±1 cm）在水中驯养7 d，待稳定后将斑马鱼随机分配到装有15 L淡水的玻璃缸中，每个缸10尾斑马鱼，每组3个重复。实验组加入菌株DZ11 并控制菌量在1×106CFU/mL。对照组仅加入淡水。将菌株DZ11在营养肉汤中培养至对数期，在超净工作台内取出3 000 r/min离心5 min，用生理盐水洗涤2次，去除培养基成分，用无菌淡水悬浮，通过测定的OD600根据标准曲线得到悬浊液的浓度，通过调节加入水中的悬浊液的量控制养殖水体中假单胞菌的浓度，使水体中菌量约为1×106CFU/mL。试验期间，斑马鱼正常饲养并且每3 d对缸内水体进行更换，换水后按上述方法重新加入菌株，持续12 d并记录斑马鱼存活数量［11］。

1.2.5 环境因素对DZ11菌株生长和脱氮性能的影响 分别研究不同C/N，pH，温度及碳源条件下DZ11菌株对氨氮，亚硝态氮和硝态氮的转化情况。C/N比分别为10、20、30、40（控制氮浓度不变，氨氮浓度为26.75 mg/L、亚硝态氮浓度为34.5 mg/L、硝态氮浓度为 40 mg/L）；pH 分别为 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；温度分别为15.0℃、20.0℃、25.0℃、30.0℃；碳源的种类分别为柠檬酸钠，草酸钠，丁二酸钠和乙酸钠，反应过程中控制单一变量，其他反应条件均不变，分别为C/N=10、pH=7、温度30℃、碳源为柠檬酸钠，转速为200 r/min。将已经培养了18-24 h的菌液按1%的接种量接种到装有100 mL已经高温灭菌过的300 mL的锥形瓶中，培养48 h，每隔8 h取一次样，检测OD600后，以3 000 r/min，5 min离心处理，取上清液检测氨氮，硝态氮和亚硝态氮的含量。

1.2.6 氮素检测方法及转化率计算 硝态氮采用紫外分光光度法（GBHJ/T346-200）检测，亚硝态氮采用N-（1-萘基）-乙二胺二盐酸盐分光光度法（GB 7493-87）测定，氨氮使用N-（1-萘基）-乙二胺二盐酸盐分光光度法（GB 7493-87）检测。去除率的计算公式如下：

C0表示 0 h 相应氮源浓度（mg/L），C1表示发酵培养后某时间相应氮源浓度（mg/L）。采用 Excel 对实验结果进行统计分析与绘图。

2 结果

2.1 菌株的形态及生理生化

DZ11在营养琼脂上形成偏米黄色菌落，透明，形状不规则，表面光滑湿润（图1）。如图2所示，菌株DZ11是长约1.4 μm，宽约0.4 μm左右的杆菌，革兰氏阴性菌，生理生化结果见表1。根据《常见细菌系统鉴定手册》，菌株DZ11的形态特征和生理生化结果和假单胞菌属较符合。

表1 菌株DZ11生理生化鉴定结果Table 1 Physiological and biochemical identification of strain DZ11

图1 DZ11菌落形态图Fig.1 Colony morphology of DZ11

图2 菌株DZ11扫描电镜图Fig.2 Scanning electron micrograph of strain DZ11

2.2 16S rDNA测序及系统发育树构建

提取DZ11的基因组DNA并对其核糖体的16S rDNA保守型序列进行PCR扩增，凝胶成像系统观察，产物切胶回收，测序。获得的序列提交至GenBank获得的登录号为 MW578872.1，结果与GenBank数据库中近缘种进行同源性分析，经过Blast对比构建绘制系统发育树，结果如图3所示。菌株DZ11与假单胞菌属施氏假单胞菌比对有超过98%的同源性，再结合生理生化结果和形态学可判断菌株DZ11是施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）并将该菌命名为Pseudomonas stutzeri DZ11。

2.3 菌株的药敏试验

菌株的药敏试验如表2所示，菌株DZ11对诺氟沙星、氯霉素、硫酸庆大霉素等常见药品都表现为敏感，因此可判断菌株DZ11无明显的耐药性。

表2 菌株DZ11对不同药品的耐药性结果表Table 2 Resistance results of strain DZ11 to different drugs

2.4 生物安全性检测

在菌株DZ11的生物安全性实验中，正常饲养条件下，第12天时，菌株DZ11实验组斑马鱼存活率为100%，空白对照组存活率为100%（图4）。本实验菌株的加入量约为1×106CFU/mL，高于病原微生物的致病剂量（1×104CFU/mL），因此可以初步判断菌株DZ11具有较高的生物安全性。

图4 菌株DZ11浸泡处理后斑马鱼存活率Fig.4 Survival rate of zebrafish soaked with strain DZ11

2.5 环境因素对菌株DZ11生长和脱氮性能的影响

2.5.1 C/N对菌株DZ11生长和脱氮性能的影响C/N对菌株DZ11生长和脱氮性能的影响如图5所示，随着C/N的增加菌株的生长情况开始逐步下降，当硝态氮为唯一氮源时，这种下降趋势最为明显，且硝态氮的转化率也随之降低，但C/N的改变对氨氮和亚硝态氮的转化率影响较小，氨氮的转化率稳定在80%左右，亚硝态氮的转化率稳定在85%以上。当C/N为10时，菌株的生长情况和脱氮性能最好。48 h后，菌株在C/N为10的培养基中对氨氮，硝态氮和亚硝态氮的转化率分别为82.05%，79.07%和94.30%。

图5 C/N比对菌株DZ11生长和脱氮性能的影响Fig.5 Effects of C/N ratio on the growth and denitrification performance of strain DZ11

2.5.2 pH对菌株DZ11生长和脱氮性能的影响 pH对菌株DZ11生长和脱氮性能的影响如图6所示，pH对菌株DZ11的生长量影响显著，酸性或碱性条件都有明显的抑制作用。当pH为7时，菌株DZ11在以氨氮，硝态氮和亚硝态氮为唯一氮源的培养基中的OD600分别为0.254 8，0.201 4，0.162 5，菌株生长最好。对氨氮、硝态氮和亚硝态氮的转化率趋势和生长趋势大致相同。在pH为5时菌株的脱氮性能处于较低的水平，随着pH的升高，脱氮效率逐渐上升，当pH到7时降解效率达到最高，氨氮，硝态氮和亚硝态氮的转化率分别84.00%，79.93%和95.23%。随着pH的继续升高，生长情况和转化率开始降低，所以菌株DZ11在pH为7时的生长和脱氮性能最优。

图6 pH对菌株DZ11生长和脱氮性能的影响Fig.6 Effects of pH on the growth and denitrification performance of strain DZ11

2.5.3 温度对菌株DZ11生长和脱氮性能的影响 温度对菌株DZ11生长和脱氮性能的影响如图7所示，当温度为15℃，菌株几乎不生长，并且脱氮性能很低，说明低温对菌株DZ11的生长和脱氮性能有着明显的抑制作用。随着温度的逐渐升高，菌株的生长量也逐渐增加。当温度上升到25℃时，菌株的生长量趋于稳定。菌株的脱氮性能随着温度的上升一直在逐渐的增加，当温度为35℃时，菌株的脱氮性能最优，对氨氮、硝态氮和亚硝态氮的转化率分别84.39%，79.93%和94.30%。

图7 温度对菌株DZ11生长和脱氮性能的影响Fig.7 Effect of temperature on the growth and denitrification performance of strain DZ11

2.5.4 碳源对菌株DZ11生长和脱氮性能的影响 碳源对菌株DZ11生长和脱氮性能的影响如图8所示，菌株在不同碳源培养基中的生长量的变化趋势和脱氮情况变化趋势较为一致且从高到底依次是柠檬酸钠、琥珀酸钠、醋酸钠和草酸钠。当以柠檬酸钠为唯一碳源时的氨氮，硝态氮和亚硝态氮的转化率分别75.56%，99.00%和97.65%。

图8 C源对菌株DZ11生长和脱氮性能的影响Fig.8 Effects of source C on the growth and denitrification performance of strain DZ11

3 讨论

在进行细菌鉴定时，单一的方法准确性较差，多种方法相结合可以使鉴定方法更加科学。不同的细菌具有不同的代谢类型，从而与各种试剂表现出不同的反应，为此利用生物化学的方法测定细菌在新陈代谢过程中所产生的代谢产物以鉴定细菌的种类。本实验结合形态学、生理生化指标和16S rDNA 基因测序分析确定了菌株DZ11为假单胞菌属施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）并命名为Pseudomonas stutzeri DZ11。

用于生态环境保护和污染防治为目的而使用的微生物菌剂需要先进行环境安全评价［13］。本实验进行了药敏试验和生物安全性试验，菌株DZ11对于常见药品无明显耐药性，并在斑马鱼的生物安全性试验中斑马鱼的存活率为100%，可以初步判断出菌株DZ11有较高的生物安全性，为菌株在使用环节中的防范和应急措施提供指导。

好氧反硝化细菌的脱氮性能受环境因素的影响较大，并且降解不同种类的氮源最佳的因素也不相同［14-20］。碳源不仅是菌体生长必须的营养源，而且也是反硝化过程中重要的能量来源和电子受体，对细菌的生长和脱氮效率具有重要影响。好氧反硝化细菌的碳源种类有很多，包括柠檬酸钠、葡萄糖、草酸钠、琥珀酸钠等。菌株DZ11在柠檬酸钠为碳源时，有最高生长量且综合脱氮性能最佳，这与Achromobacter sp.L16［21］和 Zobellella sp.［17］结果一致。在其他实验中也有发现以葡萄糖［22］、乙酸钠［23］和琥珀酸钠［8］为唯一碳源时脱氮效率最高。不同的碳源具有不同的分子量和化学结构式，会影响到菌株体内一系列的酶促反应，柠檬酸钠是一种小分子碳源，可以作为三羧酸循环的中间代谢产物，能直接被细菌所利用，被广泛的用做反硝化细菌的碳源［21］。

虽然有很多研究探究脱氮过程中的最佳C/N比，但是因为菌株种类不同探究的方向不同，得出的结果也各不相同。本实验发现，菌株DZ11在C/N为10-20之间综合脱氮性能最优，随着C/N的增加，硝态氮的降解效率直线下降，当C/N为40时，硝态氮的降解效率仅为 12.05%。这和 SQ2［8］和 L16［21］结果较为一致。Huang等［24］对菌株C.diversus进行实验得出好氧反硝化的最优C/N为4-5，Yang等［25］发现在一定范围C/N比越高，好氧反硝化过程中亚硝态氮的积累量越少，当C/N比为30时亚硝态氮的积累量最少为2.70±0.15。Zheng等［26］发现体系中C/N较低时，会有大量的亚硝态氮积累并且导致细菌生长缓慢甚至不生长。当有机碳浓度增加时，积累的亚硝态氮浓度逐渐减少，细菌生长也得以恢复。他们从总氮去除率着手，得到最佳的C/N比为15。李静等［27］对菌株HAD-2的研究中发现，当C/N比为25时，异养硝化效率最高。因此，不同菌株的最佳C/N是不一样的，具有明显的种属差异性和个体区别。

温度是影响菌株活性的重要环境因素之一，温度变化直接影响微生物的酶活，生长速度，因此只有在最佳的温度条件下，好氧反硝化细菌才能拥有最佳的脱氮性能［18］。菌株DZ11在30.0-35.0℃时的综合脱氮效率最高，在大部分的好氧反硝化菌的最佳温度范围内［28-30］，该温度适合在广东沿海地区的养殖尾水的脱氮工程中使用。何腾霞等［31］发现的耐冷型菌株Y-9的最佳温度为15℃，李誉琦等［32］发现的耐热菌株Y7在50℃高温不影响其降解亚硝酸盐的效率。这些菌株的发现扩大在极端环境下菌株的可选择范围。pH值可以影响细胞内酶的活性，而且还会影响溶液中营养物质或抑制物质的浓度，从而直接或间接影响好氧反硝化菌株的活性［33］，菌株DZ11在pH为7时脱氮性能最优，这与目前大部分好氧反硝化细菌的研究结果相似。

养殖废水中的无机氮主要为氨氮，亚硝酸盐，硝酸盐这三类。本研究发现菌株DZ11可以同时对这三类氮素都有很高的转化率，并且具有较高的生物安全性，为后续实际应用到养殖尾水脱氮工艺提供理论指导。

4 结论

从广东中山市民众镇水产养殖场底泥及污水中分离筛选出来的菌株DZ11，鉴定为假单胞菌属施氏假单胞菌并命名为Pseudomonas stutzeri DZ11；通过生物安全性实验发现，菌株DZ11无明显耐药性并且具有较高的生物安全性；菌株DZ11的最佳脱氮环境因素分别为：最优的C源为柠檬酸钠，最佳C/N比为10，最适温度为35.0℃，最适pH为7.0；菌株DZ11在以NH4-N为唯一底物时，转化率可达84.39%；在以NO3-N为唯一底物时转化率可高达99.0%；在以NO2-N为唯一底物时，转化率可高达97.65%。