火焰原子吸收光谱法测定甲钴胺中游离钴含量

梅雪娇 闫翔宇 严相平

甲钴胺是一种维生素B12的衍生物[1-2]，主要用于治疗周围神经病[3-6]。甲钴胺属于B 族维生素的一种，也是人体内唯一一种含有金属元素的维生素[7-8]。而在药品中，元素杂质是受到严格控制的。甲钴胺的合成工艺显示，甲钴胺是通过氰钴胺经还原、甲基化，得到含甲钴胺的溶液，再经过精制得到终产品[9]，因此可能存在潜在的游离钴元素。元素杂质指导原则ICH Q3D 中，根据各元素的毒性（每日允许暴露量）及其在药品中出现的可能性，将元素杂质分为3 类。1 类是人体毒素，在药品生产中应限制使用或禁用。2 类是给药途径依赖型的人体毒素。根据它们出现在药品中的相对可能性，进一步分成2A 和2B 亚类，其中2A 类元素出现在药品中的相对可能性高，2B 类元素丰度较低并且与其他物料共生的可能性较低，因此出现在药品中的概率较低。钴在药物元素杂质研究中应归属于2A 类无机杂质，因此通过测定甲钴胺中游离钴的含量，可以表征工艺清除无机杂质的能力。

由于甲钴胺结构本身含钴，必须进行样品前处理。如何将游离钴与结构钴分离，是测定游离钴的关键和难点。本研究采用大孔吸附树脂[10]对甲钴胺进行分离纯化，使游离钴从甲钴胺中洗脱。钴元素的测定多采用原子吸收光谱法、原子发射光谱法及化学法[11-12]，火焰原子吸收法检出限低，灵敏度高，分析精度好，因此本文以原子吸收法测定游离钴含量。

1 仪器、药品与试剂

1.1 仪器

原子吸收分光光度计（岛津AA/GFA-6880）；WizAArd 工作站；分析天平（赛多利斯BT25S）。

1.2 药品与试剂

甲钴胺原料药（无锡福祈制药有限公司，批号：20160402、20160403、20160404）；非极性大孔吸附树脂（Amberlite XAD 1600N）；钴单元素标准液（1000 μg/ml，国家有色金属及电子材料分析测试中心，唯一标识：17B053-2）；优级纯硝酸（国药集团化学试剂有限公司，批号：20191213）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：20200103）；盐酸（南京化学试剂股份有限公司，批号：190910089H）；氢氧化钠（南京化学试剂股份有限公司，批号：190826978E）；超纯水。

2 方法与结果

2.1 原子吸收光谱仪的参数

分析波长：钴240.7 nm；狭缝宽：0.2 nm；灯电流Low（峰值）：12 mA；点灯方式：BGC-D2；燃烧器高度：7 mm；燃烧器角度：0°；乙炔气流量：2.2 L/min；助燃气流量：15.0 L/min；助燃气的类型：空气。

2.2 溶液的制备

空白溶液及洗脱剂：0.2%硝酸溶液。树脂活化处理：将XAD1600N 树脂装柱，加无水乙醇浸泡12 h，洗脱2～3 倍柱体积，再浸泡3 h，洗脱，浸泡，洗脱，再加2%盐酸浸泡，洗脱，水洗至pH 值中性，加2%氢氧化钠浸泡，洗脱，水洗至pH 值中性[13]。装柱：选用带漏斗口的开口玻璃柱，内径1.0 cm 左右，湿法填装已活化处理后的树脂，柱床高度约20 cm。上样：称取50 mg 样品，用1 ml 浓度0.2%的硝酸溶解，小心分次上柱，并用总体积2 ml 左右的0.2%硝酸洗涤样品瓶，将洗液上柱。上柱时，控制流速均匀滴液，初始的3～5 ml 流出液不接收。洗脱：用洗脱剂进行洗脱，接收洗脱液至50 ml 量瓶中，接收至快到刻度时停止接收，加0.2%稀硝酸至刻度。

2.3 线性关系、定量限及检出限

精密量取1 ml 钴单元素标准液至20 ml 量瓶加0.2%硝酸定容制成50 μg/ml 钴标准储备液，再分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0 ml 于50 ml 量瓶中加0.2%硝酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线溶液。取空白溶液，连续测定11 次，由11 次吸光值读数的标准偏差（SD）计算检出限（3SD/K）和定量限（10SD/K），K为线性方程的斜率。取标准曲线溶液进样，以浓度C（μg/ml）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：A=9.586×10-2C+5.479×10-3。根据标准曲线的斜率及11 次空白溶液吸光值的SD 值，计算钴的定量限为0.245 3 μg/ml，检出限为0.073 60 μg/ml。

2.4 样品测定

取供试品溶液进样，依法测定，读出供试品溶液中吸光度，按上述标准曲线计算含量，结果3 批原料药中20160402 批、20160403 批及20160404 批原料中游离钴的量分别为未检出、未检出、0.010 4%。

2.5 重复性试验

称取20160404 批原料6 份，同“2.4”样品测定项下方法测定并计算钴含量。见表1。结果表明该方法重复性良好。

表1 重复性试验

2.6 加样回收率试验

精密量取钴单元素标准液适量，加0.2%硝酸定容至刻度制成10 μg/ml 钴标准储备液。称取20160404批原料9 份，每份50 mg；精密量取钴标准储备液0.25 ml、0.5 ml、1.0 ml，用0.2%硝酸稀释至1 ml，制备成分别含游离钴低、中、高浓度的同体积溶液各3 份，按样品溶液的制备方法，将其加入样品中使样品溶解后小心分次上柱，并用总体积2 ml 左右的0.2%硝酸洗涤样品瓶，将洗液上柱。接收洗脱液至50 ml 量瓶中，接收至快到刻度时停止接收，加稀硝酸至刻度，制成低、中、高浓度加入量与所取供试品中待测成分量之比为0.5∶1、1∶1、1.5∶1 的回收率溶液。依法测定，计算回收率。见表2。结果表明该方法回收率良好。

表2 加样回收率试验

3 讨论

3.1 不同型号大孔树脂吸附能力比较

非极性聚合物大孔吸附树脂是由偶极矩较小的单体聚合制得，这类树脂结构不带任何功能基，因而孔表的疏水性较强，可通过与小分子内的疏水部分的作用吸附溶液中的有机物。常见型号有XAD-1600N、D-101、D3520、HP-20 等。不同型号的树脂对同一物质的分离纯化效果是不同的，本研究拟采用不同型号的非极性聚合物大孔吸附树脂，对甲钴胺已确定游离钴含量的原料（20160404 批）进行分离纯化，并以“2.6”加样回收率试验项下方法测定并计算回收率，对甲钴胺中游离钴的分离纯化水平进行评估。骨架材料均为苯乙烯-二乙烯苯类的各型号大孔树脂试验结果显示：XAD-1600N 型大孔树脂（比表面积≥800 m2/g，平均孔径150 Å，购于陶氏）回收率为100.9%、D3520 型大孔树脂（比表面积≥480 m2/g，平均孔径85～90 Å，购于陶氏南开大学化工厂）回收率为89.66%、D-101 型大孔树脂（比表面积≥550 m2/g，平均孔径90～100 Å，购于天津市西金纳环保材料科技有限公司）回收率为92.22%、HP-20 型大孔树脂（比表面积≥590 m2/g，平均孔径290 Å，购于日本三菱）回收率为90.65%。从各型号大孔树脂分离纯化后测定游离钴的平均回收率数据结果看，XAD-1600N 型大孔树脂分离纯化效果最好，但不同型号树脂的适用范围不同，且不同厂家的树脂质量不同，吸附能力、洗脱能力也会有所差异，本试验结果仅供参考。

3.2 不同径高比比较

树脂的用量会影响目标成分的吸附情况，树脂用量过少，不足以吸附甲钴胺，用量过多，会造成死吸附，游离钴不易洗脱，拟比较不同径高比游离钴的洗脱情况。用XAD-1600N 型大孔树脂对同一批已确定游离钴含量的样品分别于径高比1∶5、1∶10和1∶20 下进行洗脱，发现树脂用量较少时，甲钴胺的特征色红色无法吸附于柱顶部，当径高比在1∶20 时，甲钴胺能够得到充分吸附，与游离钴分离。值得注意的是填充柱体积一定不能过大，过大了洗脱所需的溶剂体积增多，需接收至少3 倍柱体积洗脱液，导致溶液浓度下降，无法达到检测灵敏度要求。

3.3 洗脱速度比较

洗脱剂的洗脱体积流量是影响分离纯化效果的关键因素之一。经研究发现，洗脱体积流量太低，会导致洗脱速度过慢，延长操作时间，效率低；而洗脱体积流量太高，又会导致洗脱剂与游离钴接触时间短，不能从树脂上被充分洗脱出来，解吸附效率低。用XAD-1600N 型大孔树脂，以不同洗脱速度，对甲钴胺同批原料（20160404 批），以“2.6”加样回收率试验项下方法分别测定洗脱速度为0.50 ml/min、1.0 ml/min、2.0 ml/min 时，接收样品总需时间，并计算回收率，对甲钴胺中游离钴的分离纯化水平进行评估。试验结果显示：洗脱速度为0.50 ml/min 时，接收样品总需时间为65 min，回收率99.65%；洗脱速度为1.0 ml/min 时，接收样品总需时间为30 min，回收率101.5%；洗脱速度为2.0 ml/min 时，接收样品总需时间为15 min，回收率85.12%。综合以上试验数据，证明洗脱速度不宜过快，建议控制速度为30 min 或更长时间接收一份样品。

3.4 方法评价

本实验通过采用大孔树脂吸附，使甲钴胺中的结构钴与游离钴分离，通过实验证明本法精确度高、专属性强，解决了游离钴与主成分分离的技术难点。本研究为分析技术的难点提供了一些解决办法与思路，通过运用现代的分析手段解决当前的技术瓶颈，从而大幅提高检验效率，可为原料药的质量监控提供有效的数据支撑。