辣木籽不同提取物降血糖及降胆固醇活性测定

邵馨漫，林 琳，文 茜，徐艳妮，张金凤，刘蒲蘋，王占龙

（廊坊师范学院，河北 廊坊 065000）

0 引言

辣木籽是辣木树的种子，富含多种化学成分，主要有油脂、蛋白质、纤维素、多糖、矿物元素、黄酮、多酚等［1-2］。辣木籽具有降血压、降血糖、降胆固醇、抗氧化、抗炎、抗肿瘤［3-10］等功效。目前，对辣木籽的研究多集中在食品［11］、医药、饲料［12］、工业原料及净水［13］等领域，但辣木籽降血糖功能研究及胆酸盐结合能力鲜见报道。本文测定了辣木籽提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制能力及胆酸盐的结合能力，为辣木籽降血糖降胆固醇功能的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

材料：辣木籽。试剂：α-葡萄糖苷酶，25.4U/mg，上海源叶生物有限公司；4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷，1g，上海源叶生物有限公司；胃蛋白酶，3U/mg，上海源叶生物有限公司；阿卡波糖，250mg，山东捷采化工有限公司；二甲基亚砜（DMSO），甘胆酸钠，天津碧橙蓝生物科技有限公司；牛胆酸钠，天津碧橙蓝生物科技有限公司；水合胆酸钠，天津碧橙蓝生物科技有限公司；考来烯胺，上海源叶生物有限公司。

1.1.2 仪器设备

pH计，PH-S25，上海仪电科学仪器股份有限公司；旋转蒸发仪，LC-RE-52AA，上海力辰邦西仪器科技有限公司；分析天平，JA3003，上海力辰邦西仪器科技有限公司；BIO-RADi MarkTM酶标仪；离心机，TDZ4-WS，金坛市医疗仪器厂；可见分光光度计，7200型，优尼柯（上海）仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

降血糖活性测定样品制备：辣木籽磨粉后用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水依次萃取得提取物。将不同溶剂提取物分别用20%DMSO溶解并配制浓度分别为5mg/mL、25mg/mL、125mg/mL、250mg/mL样品溶液。阿卡波糖阳性对照用20%DMSO溶解配成5mg/mL［14］溶液。

胆酸盐结合率测定样品制备：将所得不同溶剂提取物配制浓度分别为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL样品溶液，考来烯胺阳性对照用蒸馏水溶解配成10mg/mL［15］溶液。

1.2.2 溶剂制备

参考王昭润［16］的配制方法，PNPG溶液制备：精确称取0.075g PNPG，用pH=6.8的0.01mol/L磷酸缓冲液溶解，定容至100mL，得2.5mmol/L的PNPG溶液，棕色瓶4℃保存。

0.254U/mg α-葡萄糖苷酶溶液制备：称取酶活单位为25.4U/mg的α-葡萄糖苷酶0.001g，用磷酸缓冲液稀释100倍，得0.254U/mg的α-葡萄糖苷酶溶液。

1.2.3 提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率的测定

不同浓度样品各取1mL于试管中，分别加入9mg/mL NaCl溶液2mL及4mg/mL胃 蛋白 酶 溶液2mL，用0.1mol/L的HCl溶液或0.1mol/L的NaOH溶液调节pH至2.0，37℃恒温水浴锅中孵育1h（适当振荡3-4次），得胃消化样品；96孔板中加入磷酸钾缓冲液（pH=6.8）100μL，取消化后的样品20μL及2.5mmol/L PNPG溶液20μL，37℃恒温孵育15min后，加入0.254U/mL α-葡萄糖苷酶20μL，37℃恒温反应15min。加入80μL 0.2mol/L Na2CO3溶液，用酶标仪在415nm波长处测定吸光度值A1。以蒸馏水代替α-葡萄糖苷酶，测定吸光度，记为A2，以蒸馏水代替样品，测定吸光度，记为A0。由式（1）计算α-葡萄糖苷酶抑制率，每种样品做三次平行实验，以5mg/mL阿卡波糖为阳性对照［17］。

其中：A1为415nm波长处测定的吸光度，L/（g·cm）；A2为以蒸馏水代替α-葡萄糖苷酶测定的吸光度，L/（g·cm）；A0为以蒸馏水代替样品测定的吸光度，L/（g·cm）。

1.2.4 胆酸盐标准曲线绘制

称取甘胆酸钠0.01464g，牛胆酸钠0.01614g，水合胆酸钠0.01293g，以磷酸缓冲液（pH=7.6）为溶剂，分别配制100mL母液。取上述母液0mL、0.1mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL于试管，添加磷酸缓冲液（pH=7.6）2mL、1.9mL、1.5mL、1.0mL、0.5mL、0mL。分别加入5mL浓硫酸，70℃水浴20min，取出后置于冰水中5min，分光光度计于波长387nm处测定其吸光度。以胆酸盐质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制3种胆酸盐标准曲线。

1.2.5 提取物对胆酸盐结合率的测定

分别取2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL及10mg/mL的样品溶液5mL于试管中，加入1mL 0.1mol/L HCl溶液，37℃恒温培养2h，以0.1mol/L NaOH溶液调节pH至7.6，每个样品分别加入2mL胆酸盐母液，37℃恒温培养2h。4000r/min离心20min，取2mL上层液，加入5mL浓硫酸，70℃恒温水浴20min，取出后置于冰水中5min，分光光度计于波长387nm处测定其吸光度A3，底物空白吸光度为A4。由式（2）计算胆酸盐结合率，每种样品做三次平行实验，以10mg/mL考来烯胺为阳性对照［18-19］。

其中：X样品-底物空白：将（A3-A4）作为y值，分别代入水合胆酸钠标准曲线方程为y=12.893x-0.0231，甘胆酸钠标准曲线方程为y=11.17x-0.0114，牛胆酸钠标准曲线方程为y=5.9774x-0.0044，分别求得的x值，单位：mg/mL；X胆酸盐空白为对应胆酸盐的质量浓度，mg/mL。

2 结果与分析

2.1 辣木籽不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率测定

图1-4为辣木籽不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率的测定。由图1可知，5mg/mL石油醚样品提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率为69.3%，随着石油醚样品浓度增加，其提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率无明显变化（60.4%-69.3%之间），表明辣木籽石油醚提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制不显著。由图2可知，辣木籽乙酸乙酯相提取物浓度在5mg/mL、25mg/mL、125mg/mL、250mg/mL对α-葡萄糖苷酶抑制率分别为77.6%、84.5%、97.1%、98.9%。由此可知，随着辣木籽乙酸乙酯提取物浓度增加，α-葡萄糖苷酶抑制率逐渐增大。辣木籽乙酸乙酯相提取物浓度在125mg/mL和250mg/mL对α-葡萄糖苷酶抑制率均大于阳性对照（92.5%）。由图3可知，辣木籽正丁醇相提取物浓度在5mg/mL、25mg/mL、125mg/mL、250mg/mL对α-葡萄糖苷酶抑制率分别为62.80%、73.60%、86.00%、99.50%。由此可知，辣木籽正丁醇相提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率随浓度的增大而增大。当辣木籽正丁醇相提取物浓度为250mg/mL时，α-葡萄糖苷酶抑制率达到99.5%，大于阳性对照（92.5%）。由图4可知，辣木籽水相提取物浓度为5mg/mL、25mg/mL、125mg/mL、250mg/mL时，对α-葡萄糖苷酶抑制率分别为54.70%、80.00%、86.20%、93.30%。表明随着辣木籽水相提取物浓度增加，α-葡萄糖苷酶抑制率逐渐增大。当辣木籽水相提取物浓度为250mg/mL时，α-葡萄糖苷酶抑制率达93.30%，大于阳性对照（92.50%）。

图1 辣木籽不同浓度石油醚相提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率

图2 辣木籽不同浓度乙酸乙酯相提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率

图3 辣木籽不同浓度正丁醇相提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率

图4 辣木籽不同浓度水相提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率

2.2 辣木籽胆酸盐标准曲线测定

水合胆酸钠标准曲线方程为y=12.893x-0.0231，相关系数R2为0.999。甘胆酸钠标准曲线方程为y=11.17x-0.0114，相关系数R2为0.9991。牛胆酸钠标准曲线方程为y=5.9774x-0.0044，相关系数R2为0.9994。三种标准曲线相关性良好，可用于后续实验。

2.3 辣木籽不同溶剂提取物对胆酸钠结合率的测定

2.3.1 辣木籽不同溶剂提取物对水合胆酸钠结合率的测定

图5-8为辣木籽不同溶剂提取物对水合胆酸钠结合率的测定。由图5可知，随着辣木籽石油醚提取物浓度增加，水合胆酸钠的结合率逐渐增大。辣木籽石油醚相提取物浓度为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL时，对水合胆酸钠的结合率分别为79.3%、79.4%、84.3%、88.8%、96.4%。辣木籽石油醚相提取物浓度在10mg/mL对水合胆酸钠的结合率大于考来烯胺阳性对照（91.2%）。由图6可知，随着样品浓度的增加，乙酸乙酯相提取物对水合胆酸钠结合率先增加后趋于平缓（73%-79.3%之间），且均低于考来烯胺阳性对照（91.2%），表明辣木籽乙酸乙酯相提取物对水合胆酸钠结合作用不明显。由图7可知，随着样品浓度的增加，正丁醇相提取物对水合胆酸钠结合率逐渐增加（73.3%-86.7%之间），且均低于考来烯胺阳性对照（91.2%），表明辣木籽正丁醇相提取物对水合胆酸钠结合作用不明显。由图8可知，随着辣木籽水相提取物浓度增加，水合胆酸钠的结合率逐渐增大。辣木籽水相提取 物 浓 度 为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL时，对水合胆酸钠的结合率分别为76%、79%、88%、88.4%、94.2%。辣木籽水相提取物浓度为10mg/mL时，对水合胆酸钠的结合率大于考来烯胺阳性对照（91.2%）。

图5 辣木籽不同浓度石油醚相提取物对水合胆酸钠结合率

图6 辣木籽不同浓度乙酸乙酯相提取物对水合胆酸钠结合率

图7 辣木籽不同浓度正丁醇相提取物

图8 辣木籽不同浓度水相提取物对水合胆酸钠结合率

2.3.2 辣木籽不同溶剂提取物对甘胆酸钠结合率的测定

图9-12为辣木籽不同溶剂提取物对甘胆酸钠结合率的测定。由图9可知，随着辣木籽石油醚相提取物浓度增加，甘胆酸钠的结合率逐渐增大。辣木籽石油醚相提取物浓度为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL时，对甘胆酸钠的结合率分别为76.8%、77.2%、82.8%、91.5%、91.2%。辣木籽石油醚相提取物浓度为8mg/mL和10mg/mL时，对甘胆酸钠的结合率均大于考来烯胺阳性对照（90.2%）。由图10可知，随着样品浓度的增加，乙酸乙酯相提取物对甘胆酸钠结合率无明显增大（69.3%-90%之间），且均低于考来烯胺阳性对照（90.2%），表明辣木籽乙酸乙酯相提取物对甘胆酸钠结合作用不明显。由图11可知，随着样品浓度的增加，正丁醇相提取物对甘胆酸钠结合率先增加后减少（66.7%-81.2%之间），且均低于考来烯胺阳性对照（90.2%），表明辣木籽正丁醇相提取物对甘胆酸钠结合作用不明显。由图12可知，随着辣木籽水相提取物浓度增加，甘胆酸钠的结合率逐渐增大。辣木籽水相提取物浓度为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL时，对甘胆酸钠的结合率分别为82%、89.1%、89.6%、92.4%、91.3%。辣木籽水相提取物浓度在8mg/mL和10mg/mL时，对甘胆酸钠的结合率均大于考来烯胺阳性对照（90.2%）。

图9 辣木籽不同浓度石油醚相提取物对甘胆酸钠结合率

图10 辣木籽不同浓度乙酸乙酯相提取物对甘胆酸钠结合率

图11 辣木籽不同浓度正丁醇相提取物对甘胆酸钠结合率

图12 辣木籽不同浓度水相提取物对甘胆酸钠结合率

2.3.3 辣木籽不同溶剂提取物对牛胆酸钠结合率的测定

图13-16为辣木籽不同溶剂提取物对牛胆酸钠结合率的测定。由图13可知，随着样品浓度的增加，牛胆酸钠的结合率逐渐增大（61%-80.2%），且均低于考来烯胺阳性对照（91.5%），表明辣木籽石油醚相提取物对牛胆酸钠结合作用不明显。由图14可知，随着样品浓度的增加，辣木籽乙酸乙酯相提取物对牛胆酸钠的结合率先减少后增加（44.5%-90.1%），且均低于考来烯胺阳性对照（91.5%），表明辣木籽乙酸乙酯相提取物对牛胆酸钠结合作用不明显。由图15可知，随着辣木籽正丁醇相提取物浓度增加，牛胆酸钠的结合先减少后增加。辣木籽正丁醇相提取物浓度在2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL对牛胆酸钠的结合率分别为77.7%、63.4%、91.2%、92%、90.2%。辣木籽正丁醇相提取物浓度在8mg/mL对牛胆酸钠的结合率大于考来烯胺阳性对照（91.5%）。由图16可知，随着辣木籽水相提取物浓度增加，牛胆酸钠的结合率逐渐增大。辣木籽水相提取物浓度在2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL对牛胆酸钠的结合率分别为62%、74%、87.4%、93.1%、94%。辣木籽水相提取物浓度在8mg/mL和10mg/mL对牛胆酸钠的结合率均大于考来烯胺阳性对照（91.5%）。

图13 辣木籽不同浓度石油醚相提取物对牛胆酸钠结合率

图14 辣木籽不同浓度乙酸乙酯相提取物对牛胆酸钠结合率

图15 辣木籽不同浓度正丁醇相提取物对牛胆酸钠结合率

图16 辣木籽不同浓度水相提取物对牛胆酸钠结合率

3 结论

本研究按照溶剂极性由小到大的顺序选取石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水依次对辣木籽进行萃取，分别配制辣木籽不同溶剂提取物样品溶液，测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性。结果表明，辣木籽水相、正丁醇相及乙酸乙酯相提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性随提取物浓度的增加而增大。当乙酸乙酯、正丁醇及水相提取物在250mg/mL浓度时，具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制率均高于阳性对照。不同浓度石油醚相样品提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率无明显变化，均低于阳性对照。表明辣木籽水相、正丁醇相、乙酸乙酯相提取物中存在α-葡萄糖苷酶活性抑制物，而石油醚相中无明显α-葡萄糖苷酶抑制物。

辣木籽不同极性提取物胆酸盐结合试验结果表明，辣木籽水相提取物对水合胆酸钠、甘胆酸钠及牛胆酸钠结合能力均较强。辣木籽石油醚相提取物对水合胆酸钠和甘胆酸钠具有较强的结合能力。辣木籽正丁醇相提取物对牛胆酸钠结合能力较强。辣木籽乙酸乙酯相提取物对三种胆酸盐无明显结合能力。

本研究测定了辣木籽不同极性提取物的降血糖及降胆固醇能力，初步明确辣木籽降血糖及降胆固醇有效部位，为后续活性单体物质的分离纯化奠定基础。后续将对功能性组分单体物质进行分离纯化，以期发现降血糖、降胆固醇活性单体物质。