G蛋白偶联受体75去孤儿化研究及在疾病中的作用*

吉雨恬，刘恋恋，刘娇莉，张 淳，李开远，郭立荣，曾俊伟，韩 勇

（遵义医科大学生理学教研室，贵州 遵义 563000）

G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors，GPCRs）是已知人类基因组中最大的一类膜蛋白受体家族，包括A类视紫红质样受体、B类分泌素受体、C类代谢型谷氨酸受体、D类真菌交配信息素受体、E类环腺苷酸受体及F类卷曲受体（Frizzled/Smoothened家族）［1-2］。其中A类视紫红质样受体包含了GPCRs中大部分种类，共含有19个子类（A1～A19）719种，是目前临床上大多数药物作用的潜在靶点［3-4］。在A类视紫红质样受体家族中，目前已知197种受体存在明确的配体（不包括嗅觉、视觉、味觉及犁鼻器感觉受体），但87种受体目前尚不清楚其内源性配体，被称为“孤儿（orphan）受体”，其中54种孤儿受体至少有一篇文献报道了其可能的内源性配体［5］。探寻并鉴定孤儿GPCRs的内源性配体的研究即为GPCRs的去孤儿化（deorphanization）［6］，但由于大部分内源性配体的特性未知及相关工具药物的缺乏，相关受体的去孤儿化研究受到较大限制。目前，鉴定内源性配体的研究策略主要有受体-配体绑定分析、受体内化激活分析、β-arrestin募集分析及环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）生成、钙离子信号通路检测等方法［6-7］。

G蛋白偶联受体75（G-protein-coupled receptor 75，GPR75）被国际基础与临床药理学联合会列为孤儿受体之一［5］。在最近的研究中发现，GPR75可与CC基序趋化因子配体5（C-C motif chemokine ligand 5，CCL5）或20-羟二十烷四烯酸（20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE）交互作用［8-9］，与高血压、神经退行性病变、肿瘤、肥胖相关代谢综合征等疾病相关。

1 GPR75概述

1999年，Tarttelin等［10］在人类基因组中鉴定出Gpr75基因，它定位于人类染色体2p16区，可编码分子量为59.4 kD、含有540个氨基酸的蛋白质，该蛋白具有典型的GPCRs特征，即7个跨膜结构域、位于N末端的N-糖基化位点及位于C末端的丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点。后续研究证实GPR75属于A类视紫红质样家族的Gαq蛋白偶联受体，与秀丽隐杆线虫神经肽Y受体（24%同源）、大鼠甘丙肽受体3（25%同源）和猪生长激素促分泌素1b型受体（25%同源）具有相关同源性［10-11］。早期的研究认为，GPR75主要在视网膜和中枢神经系统中表达，但其具体功能或者与相关疾病的关系不清楚，如Sauer等［12］研究未发现GPR75与视网膜相关疾病有密切关联。后续研究证实，GPR75有广泛的表达谱，在中枢神经系统、心脑血管系统以及胰岛、前列腺等组织、器官中表达［8-9］，且其功能以及与相关疾病联系逐渐被揭示。

2 GPR75去孤儿化研究

2.1 GPR75与CCL5CCL5属于CC类亚族的炎症趋化因子，主要在T淋巴细胞和单核细胞中表达［13］。CCL5作为配体可与CC类趋化因子受体1（CC chemokine receptor 1，CCR1）、CCR3和CCR5结合，尤其与CCR5亲和力最高［14］。CCL5/CCR5配对与细胞增殖、迁移以及血管生成相关，在炎症、肿瘤发生、病毒感染等疾病中发挥重要作用［15-16］。

2006年，Ignatov等［8］报道CCL5可能与另外一种视紫红质样孤儿受体GPR75结合。该研究分别在过表达GPR75的HEK293细胞、内源性表达GPR75的小鼠海马神经元HT22细胞以及CV-1细胞中，发现CCL5具有刺激细胞内IP3累积、Ca2+浓度增加以及激活蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路作用。而CCL5的上述效应可被磷酯酶C（phospholipase C，PLC）信号通路 抑 制剂U73122或者磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抑制剂渥曼青霉素所阻断。Liu等［17］在小鼠及人类胰岛的β细胞中观察到，已知的CCL5受体CCR1、CCR3和CCR5的表达水平非常低，但却显著表达GPR75，当下调Gpr75表达后，可有效阻断CCL5诱导的Ca2+增加和促胰岛素分泌作用。Dedoni等［18］的研究发现，在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中，分别 应用CCR1抑制剂BX471、CCR3抑 制 剂SB328437或者CCR5抑制剂DAPTA，不能阻断CCL5所诱导的AKT、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）及细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）的磷酸化。但敲减Gpr75表达后，却可有效阻断CCL5的上述效应。最近，在一项关于GPR54、GPR56和GPR75在胰腺β细胞功能调控中的作用研究中发现，CCL5作为GPR75配体参与刺激胰岛素分泌和改善血糖稳态，可促进MIN6胰腺β细胞胰岛素分泌［19］。

CCL5与GPR75之间作用关系，目前仅有如上4项相关研究（表1）提出CCL5可能是孤儿受体GPR75内源性配体的观点，但这些研究均未观察CCL5与GPR75之间直接绑定或相互结合作用，并且Southern等［20］通过β-arrestin募集试验筛选孤儿GPCRs天然配体的研究中，未能证实CCL5对GPR75的激活作用。

2.2 GPR75与20-HETE20-HETE是由细胞色素P450酶（Cytochrome P450，CYP450）家族中CYP4A/4F酶催化花生四烯酸代谢生成的血管活性物质［21］。近年在临床以及动物模型研究中发现，20-HETE参与高血压、脑卒中、缺血性心肌病、心力衰竭等心脑血管疾病的发生与发展［22-25］。研究证实，20-HETE存在结构类似物并且可拮抗20-HETE的生物学作用［26］，提示20-HETE作用受体的存在。但是，由于20-HETE具有较高的脂溶特性，会被快速酯化成磷脂，因而对于20-HETE是否绑定并结合膜受体蛋白继而发挥生物学作用的研究进展缓慢。

2017年，Garcia等［9］在血管系统中发现GPR75表达，并鉴定出20-HETE可激活并绑定该受体，证实20-HETE以GPR75依赖机制诱导血管内皮功能紊乱及平滑肌细胞收缩。该研究发现，在血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）中，20-HETE具有激活GPR75作用，引起后者与其偶联的Gαq蛋白解离，继而激活PLC信号通路引起细胞内IP3生成；IP3生成不仅是GPCRs激活的标志物，并能通过蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）途径以及肌浆网IP3受体门控通道诱发细胞内Ca2+浓度升高，从而增强VSMC收缩［9］。同样，在血管内皮细胞中，20-HETE通过与GPR75配对机制，激活G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1（G-protein-coupled receptor kinase-interacting protein 1，GIT1），诱导表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）磷酸化，通过NF-κB信号通路引起血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）表达，导致内皮细胞功能紊乱［9］。另外，该研究中未观察到CCL5处理后GPR75与Gαq蛋白解离现象，这与Southern等［20］发现CCL5不具有激活GPR75作用的报道相一致。

最近，包括本课题组在内的多项研究，证实了20-HETE/GPR75信号途径在多种器官组织及相关疾病中发挥重要作用（表1）。Cárdenas等［27］在前列腺癌PC-3细胞中发现GPR75表达，且20-HETE处理后促进了EGFR、NFκB、AKT和p38的磷酸化；而沉默Gpr75表达，或应用一种水溶性的20-HETE受体拮抗剂——N-disodium succinate-20-hydroxyeicosa 6（Z），15（Z）-diencarboxamide（AAA）阻断GPR75的作用，则可逆转20-HETE的上述效应。Gilani等［28］在3T3-1分化的脂肪细胞中发现类似现象，观察到AAA可阻断20-HETE对胰岛素受体Tyr972位点磷酸化的抑制作用。在最近的一项研究中，Pascale等［29］观察了20-HETE、CCL5与GPR75之间的交互作用关系。一方面发现，CCL5虽然可诱导HTLA细胞和人内皮细胞内Ca2+浓度增加，但并非呈GPR75依赖性；反之，过表达GPR75后CCL5诱导的细胞内肌醇1-磷酸（inositol 1-phosphate，IP-1）的累积和Ca2+浓度呈下降趋势；另一方面，使用CCL5处理后却明显抑制20-HETE诱导细胞内Ca2+浓度增加以及IP-1的积累，还阻断了20-HETE诱导的β-arrestin募集增加［29］。如上结果提示，20-HETE、CCL5与GPR75具有不同的结合位点，20-HETE是GPR75的高亲和力配体，而CCL5作为低亲和性配体结合GPR75后，竞争性抑制20-HETE对GPR75的激活 作 用，因 此CCL5可能 是20-HETE/GPR75绑定的负性调控因子。

表1 GPR75的潜在配体及在疾病中作用Table 1.Putative ligands of G-protein-coupled receptor 75（GPR75）and its role in diseases

笔者所在实验室在培养的乳鼠心肌细胞及大鼠H9c2心肌细胞中观察到，GPR75在mRNA和蛋白水平表达，使用20-HETE处理后心肌细胞内IP3含量、Ca2+浓度及活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高，同时PKC、NADPH氧化酶活性增强；敲减Gpr75表达或者阻断PLC以及PKC信号通路，则可逆转20-HETE如上效应［30-31］。这提示20-HETE/GPR75信号途径在心脏生理、病理进程中发挥重要作用。

综上所述，Ignatov等［8，17-19］认为GPR75是趋化因子受体CCR1、CCR3和CCR5之外CCL5的第4种受体，主要证据来自于CCL5诱导IP3累积和Ca2+浓度升高等作用，但这些研究均未开展二者之间直接绑定作用的研究，且不能被β-arrestin募集试验所证实［20］。Garcia等［9，27-31］在不同组织器官中鉴定出一种新的GPR75可能配体——20-HETE，其中Pascale等［29］探讨了CCL5和20-HETE与GPR75之间的作用关系，认为CCL5可能是20-HETE与GPR75相互作用的负性调控因子。虽然GPR75内源性配体的研究尚存争议，但GPR75生物学功能及与相关疾病关系的研究得以逐步深入。

3 GPR75功能及与相关疾病关系

3.1 GPR75在神经系统中的作用GPR75首先被鉴定在脑、脊髓以及视网膜等部位表达，但初期研究并未发现其与相关神经系统疾病关联［10-12］。Ignatov等［8］在对CCL5和GPR75配对的作用和机制研究中，发现GPR75介导了CCL5的神经保护功能。β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）在神经组织中的累积被认为具有较强的神经毒性作用，与阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）中神经元变性相关［32］。Ignatov等［8］发现在内源性表达GRP75的海马神经元HT22细胞中，CCL5可有效抑制Aβ诱导的神经细胞凋亡，而过表达GPR75后增强了该效应。Dedoni等［18］在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中研究发现，CCL5可 通 过GPR75诱 导Gαq蛋 白 下 游AKT和MAPK等蛋白磷酸化激活，这两种蛋白激活具有抗凋亡和促神经细胞存活作用，这可能是GPR75发挥神经保护功能的分子机制。

与CCL5在神经系统中的作用不同，20-HETE被认为具有神经毒性作用，参与脑卒中、认知障碍和AD的发生、发展［33］。神经系统的活动增强需与局部血流的增加相匹配，被称为神经血管偶联（neurovascular coupling，NVC）［34］。在脑卒中患者的脑脊液和血浆中，20-HETE含量增加，导致卒中后脑血流量减少，不能满足神经元活动增加后的能量需求，从而诱发NVC受损，抑制20-HETE生成可有效改善缺血后脑血管痉挛及梗死面积的增加［35-36］。最近Gonzalez-Fernandez等［37］进一步检测了20-HETE合成酶——CYP4A与GPR75在大鼠脑组织中的表达关系。发现在脑的新皮层、内嗅皮层等多个部位同时表达CYP4A和GPR75，但星形胶质细胞中只表达CYP4A。此外，二者在脑血管的软脑膜动脉、穿通小动脉的内皮细胞、VSMC以及周细胞中均有表达［37］，提示20-HETE可能以旁分泌方式通过GPR75介导，影响脑血管VSMC和周细胞功能。

3.2 GPR75对心血管系统功能的影响血管系统中，近年来在多种动物模型中观察到GPR75参与高血压发生、发展。如在Cyp4a12转基因小鼠诱导的20-HETE依赖性高血压的动物模型中，敲减Gpr75表达可有效降低多西环素处理的Cyp4a12小鼠血压升高，同时降低ACE表达并明显改善Cyp4a12转基因小鼠血管内皮功能紊乱［9］。在另一种Cyp1a1-Ren-2转基因大鼠诱导的血管紧张素II（angiotensin II，Ang II）依赖性恶性高血压动物模型中，应用20-HETE受体拮抗剂AAA阻断GPR75作用，可有效逆转3-吲哚甲醇处理后大鼠恶性高血压的发生与发展，这与阻断GPR75作用后减少血浆及肾脏中Ang II水平有关［38］。最近，Agostinucci等［39］构建了一种VSMC靶向过表达Cyp4a12转基因小鼠，该动物模型特异性表现出VSMC收缩特性增强并呈20-HETE依赖性高血压和血管功能障碍，应用AAA处理后同样可有效降低动物血压，并可改善由乙酰胆碱诱导的

血管舒张功能受损。Tunctan等［40］在脓毒症休克大鼠模型中，发现20-HETE类似物——5，14-HEDGE，同样具有激活GPR75作用，并可有效抑制脂多糖诱导的大鼠低血压及心动过速反应，而使用AAA可逆转5，14-HEDGE如上作用。这些研究初步揭示了GPR75参与高血压的作用和机制，敲减GPR75表达或者阻断其作用可有效发挥降低血压作用，为临床治疗高血压疾病提供了新的思路和动物实验依据。

GPR75对心脏功能的影响研究较少。笔者所在实验室报道了GPR75在培养的乳鼠心肌细胞及大鼠H9c2心肌细胞中表达，慢病毒敲减Gpr75表达或阻断GPR75下游信号通路作用，可有效抑制20-HETE诱导的心肌细胞凋亡，这可能是20-HETE参与诱导缺血性心肌病重要受体机制，为拓展GPR75在心脏中的功能提供了新的线索［30-31］。但20-HETE在心脏中对GPR75的激活作用及其机制尚需进一步研究。

3.3 GPR75在代谢综合征中作用GPR75的两个潜在假定配体CCL5与20-HETE在代谢综合征中均发挥重要作用。有研究报道，CCL5具有抑制葡萄糖刺激诱导胰高血糖素样肽1和胰高血糖素样肽2的分泌作用，从而导致小鼠葡萄糖依赖性的胰岛素分泌受损［41］。此外，在超重和肥胖者血浆内CCL5水平显著升高，与体重指数（body mass index，BMI）及体脂率呈正相关，且CCL5/CCR5信号通路的激活加剧肥胖发生和胰岛素抵抗［42-43］。同样，20-HETE也与BMI、高血糖和血浆胰岛素水平呈正相关，是导致体重增加、升高空腹血糖水平和胰岛素抵抗的重要因素［44］。最近，Gilani等［28］证实，GPR75的激活是20-HETE诱导肥胖相关糖尿病及胰岛素分泌信号通路障碍的必要条件。

GPR75参与肥胖相关代谢综合征的重要发现来自Akbari等［45-46］最近在《Science》的报道。该研究通过人类大规模外显子组测序技术，对分别来自英国、美国和墨西哥共64.5万名个体的外显子组样本进行测序，评估罕见基因编码变异与BMI之间的相关性，共鉴定出16个与BMI高度相关的外显子基因突变，包括5种在神经系统表达的GPCRs（CALCR、MC4R、GIPR、GPR151和GPR75）；在约4/10 000个测序个体中发现存在GPR75蛋白截断突变（proteintruncating variants），这些个体的BMI平均降低1.8 kg/m2，体重降低5.3 kg，较非杂合子个体肥胖风险几率降低54%［45］。为进一步确证GPR75在抑制肥胖发生中的作用，该研究在高脂饮食诱导的小鼠肥胖模型中发现，喂食14周后未处理小鼠体重增加1倍，而Gpr75基因缺失的杂合子（Gpr75+/-）小鼠体重较正常小鼠减轻25%，而Gpr75基因缺失的纯合子（Gpr75-/-）小鼠体重减轻达到45%。此外，缺失1个或2个Gpr75基因拷贝的小鼠在对葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性方面也得到有效改善［45］。该研究通过遗传学分析证据及动物实验研究揭示了Gpr75基因在肥胖中的重要作用，提示抑制GPR75活性或研发靶向GPR75的基因沉默药物、抗体或小分子调节剂，对于预防肥胖及治疗代谢综合征具有广阔应用前景。

4 问题与展望

近年来，尽管GPR75的去孤儿化研究及对相关疾病的影响得到深入开展，但仍存在诸多问题尚待揭示。首先，GPR75的内源性天然配体研究尚存争议，目前国际基础与临床药理学联合会仍将GPR75列为孤儿受体［5］。基于目前的研究，在GPR75的2个潜在假定配体中，20-HETE与GPR75的亲和力要高于CCL5，Pascale等［29］认为CCL5可作为负性调控因子影响20-HETE与GPR75的绑定结合。因此，尚需在更多的组织器官中深入研究GPR75、20-HETE和CCL5之间是否存在类似的交互作用关系。其次，作为GPR75可能的配体，20-HETE/GPR75配对机制也需在其他组织、器官中进一步确认。如心脏是20-HETE发挥生理、病理作用的重要器官，但目前尚待明确GPR75在20-HETE诱导的心肌损伤中的重要作用，尤其是20-HETE对GPR75激活的机制还不清楚。此外，尚不能确定GPR75是否是20-HETE的唯一受体。目前的研究证据显示，在各组织器官中可能存在不同的GPR75亚型，或者表达其他可以与20-HETE结合的受体。如以往的研究证实20-HETE在肾脏近曲小管及髓袢升支粗段具有抑制Na+转运作用，通过促进钠尿排泄从而在血压调节中发挥作用［47］。但是Garcia等［9］在肾脏组织中，并未发现GPR75表达，提示GPR75可能在不同组织中存在多种亚型或剪接变异体，或者GPR75可能并不是20-HETE的唯一受体。实际上，Trauelsen等［48］最近研究报道，20-HETE可通过激活另一种受体——游离脂肪酸受体1而发挥促胰岛素分泌作用。

虽然GPR75配体及生物学功能尚存诸多值得深入探究的科学问题，但GPR75已展现出在高血压、心脑血管疾病、神经系统疾病，尤其在肥胖相关代谢综合征中发挥重要作用。因此，作为典型的GPCRs，GPR75有望成为新的可高度药物化的靶点，研发靶向GPR75的激动剂或拮抗剂药物是未来可能取得突破的领域。事实上，近期阿斯利康（AstraZeneca）和再生元（Regeneron）公司已经开始合作研发靶向Gpr75基因沉默药物、抗体或小分子调节剂，以期预防肥胖及治疗与其相关的共病。不仅如此，GPR75有望成为新的治疗血脂异常、糖尿病、心脑血管疾病、神经系统疾病的药物作用靶点。