聚焦超声开放血脑屏障联合纳米药物递送系统的研究进展

赵鎏丹 杨贵君 邵祺晖 周志璇 金安辰 刘昕奕 崔德荣

过去20年，纳米技术得到深入研究并被广泛应用于多种疾病的诊断和治疗。目前已构建多种可用于体内药物递送的纳米粒子(nanoparticle，NP)，包括脂质体、树状聚合物、胶束、聚合物纳米颗粒和无机纳米颗粒等[1]，这些NP可装载治疗药物或成像探针，并精准地投递至靶组织或细胞。NP具有诸多优点，如提高药物溶解度，保护所载药物免于酶消化，提高靶向效率，增强细胞同化等。此外，由两亲性聚合物与药物偶联(简称聚合物-药物偶联物)的纳米药物递送系统(nanoparticles drug delivery system, NPDDS)亦具有其他一些特性，如增加药物载量，减少爆裂式释放，实现双药或多药的共载等[2-3]。基于NPDDS的聚合物胶束已被研发，作为一种靶向癌症治疗的传递系统，其中一些聚合物胶束已进入临床试验[4-5]。

NPDDS在治疗中枢神经系统(central nervous system，CNS)疾病中的作用与血脑屏障(blood brain barrier，BBB)对相关NP的通透性密切相关。研究[6]结果表明，BBB可有效阻挡约98%的小分子物质和几乎所有的外源性大分子物质，致使多数药物无法在CNS内达到应有的治疗浓度，这严重影响了诸如新生儿缺血缺氧性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)等CNS疾病的治疗效果。因此，找到一种能有效透过BBB达到靶区脑组织的药物递送系统，已成为当前脑科学研究的热点与难点。

聚焦超声(focused ultrasound，FUS)联合微泡(microbubbles，MBs)技术已被证实能够瞬时、可逆、无创地开放BBB[7]，通过增加BBB通透性，促进药物、抗体、基因、细胞等在靶区脑组织的高效释放，增加局部药物浓度，减少不良反应的发生。FUS联合MBs已显示出较好的临床应用前景。

本文结合BBB的生物学理论知识，梳理了基于NP的脑组织靶向药物递送系统和FUS联合MBs技术的最新研究进展，同时探讨存在的局限，以期为各位同仁深入研究NPDDS靶向治疗CNS疾病，突破NP技术瓶颈提供思路。

1 BBB对药物进入脑组织的影响

BBB是CNS独有的物质交换调节结构，由脑组织的连续毛细血管内皮细胞(blood capillary endothelial cell，BCEC)及细胞间紧密连接(tight junction，TJ)、完整的基膜、周细胞和星形胶质细胞脚板组成的神经胶质膜所构成；作为代谢屏障，其能够代谢和灭活多种药物，以及对神经活性有毒害作用的化合物和酶[8-9]。TJ是BBB发挥作用的关键结构。TJ连同BCEC形成一个扩散屏障，选择性地阻止大多数血液播散物质进入大脑。星形胶质细胞主要参与TJ屏障的诱导和维持，但不参与BBB的屏障作用[9-10]。正是在这些结构的配合下，某些大分子、水溶性或解离型药物难以进入脑组织，只有脂溶性较高的药物才能以被动扩散的方式透过BBB。这在一定程度上维持了CNS内环境的稳定，但同时也为CNS相关疾病的治疗带来了诸多限制。

2 药物透过BBB的研究进展

2.1 NPDDS NPDDS呈高比表面积特性，具备亲和性、极性等一些特殊的表面性能。由于NP能保护药物及促进其被机体吸收，故NPDDS有助于解决小分子被代谢和大分子毒性等问题，即维持药物有效剂量下的药理学活性。但目前，NPDDS尚面临如何降低网状内皮细胞吞噬NP的比例，提高药物透过率，增强药物靶向性，提高药物生物利用率，以及延长药物体循环时间等问题。对载体的筛选与优化，以及利用不同基团或配体[如表面活性剂、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、特异性靶向基团和外部靶向信号]对纳米载体进行修饰是当前主要的研究方向[11]。Zheng等[12]研发了一种纳米激动剂(nanoagonist，NA)，在脑缺血时使用可增加BBB的通透性，以促进神经保护剂的吸收，其原理为通过激活腺苷2A受体以暂时性地开放BBB。研究结果显示，NA与超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)联用，可使鼠脑缺血体积比单用SOD缩小80%左右。

由于肿瘤组织的血液灌注较其他组织略低，因此，NPDDS存在对肿瘤部位药物递送不充分的问题。鉴于肿瘤组织中内皮素-1 (endothelin-1，ET1)-内皮素A型(endothelinreceptor A，ETA)受体信号通路在维持肿瘤血管肌原性张力中的重要作用，Zhang等[13]认为抑制ET1-ETA受体信号通路或可选择性地改善肿瘤组织的灌注，协助纳米药物向肿瘤的递送。该研究团队通过免疫荧光染色检查发现，与正常脑组织相比，ETA受体在U87 MG胶质母细胞瘤组织中过表达；进一步经体内光声成像检查证实，采用 0.5 mg/kg ETA受体拮抗剂(BQ123)单次给药可有效改善肿瘤组织灌注。此外，通过体外的声光成像证实，BQ123的单一治疗可显著改善肿瘤组织内115 nm大小NP的聚集度和分布的均匀性；BQ123还可增加负载紫杉醇NP的治疗效果，显著延长原位移植瘤型胶质母细胞瘤小鼠的生存时间。

鉴于含有烷氧侧链结构的氰基丙烯酸酯具有良好的亲水性，李云凤[14]设想如果以此种材料制备纳米微球(nanospheres，NS)，在侧链烷氧基团的影响下，NS可以呈现出较好的亲水性，同时通过Tween-80的修饰，可产生叠加效果，以提高其网状内皮细胞(BBB的组成细胞)的药物透过率。实验中，该研究团队以靶向肿瘤细胞转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASON)为模型药物，分别合成了两种含有烷氧侧链的氰基丙烯酸酯，并以不含烷氧侧链的氰基丙烯酸正丁酯为对照组，合成了共聚或均聚的NP各3种。分别观察这6种NP对ASON的保护效应及递送能力，以及透过BBB向靶部位递送药物能力的差异。该实验结果证实，含有烷氧侧链的氰基丙烯酸酯能够增加NP透过BBB的数量；并且起到缓释ASON的效果，提高其生物利用率。该实验所设计的新型脑靶向载体在未来具有运输核酸药物的潜力。

苏州大学的欧阳佳等[15]根据含硫五元环的环状碳酸酯单体(dimethyl-trimethylene carbonate, DTC)和三亚甲基碳酸酯(trimethylene carbonate, TMC)的新型共聚物PEG-P具有较好的还原响应性及生物相容性的特征，推测这种共聚物可作为一种良好的药物运输载体。实验中，该研究团队选取载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)作为药物靶向分子，因为该分子可更好地靶向胶质瘤与BBB共表达的LRP1受体。研究结果表明，以共聚物PEG-P作为药物阿霉素(doxorubicin, DOX)的载体，能够提高DOX在BBB中的透过率，释放于胶质瘤部位，增强治疗效果。

八聚精氨酸(octa arginine, R8)具有较强的细胞膜穿透特性及阳离子特性，转铁蛋白(transferrin, Tf)修饰能够赋予该脂质体靶向脑肿瘤的能力。据此，王曦[16]构建了细胞穿膜肽(cell-penetrating peptide，CPP)和Tf共修饰的DOX脂质体模型，赋予其主动靶向BBB和肿瘤细胞的高效穿膜能力。首先利用Tf介导脂质体主动靶向BBB，其次利用CPP介导脂质体高效穿过BBB；进入脑组织后，再利用Tf介导脂质体靶向脑胶质瘤细胞，利用CPP介导脂质体穿过细胞膜；最终将DOX送达肿瘤细胞质。研究者进一步通过体内实验证实，Tf-R8PLP[Tf和油酸连接的R8(oleic acid-R8，OA-R8)共修饰脂质体递送DOX系统]组的小鼠生存时间较阴性对照组、DOX组和R8PLP组(OA-R8修饰脂质体递送DOX系统)均显著延长(25 d比20、22、24 d)。证实Tf-R8PLP对脑胶质瘤具有良好的治疗效果。

Alawdi等[17]研究证实纳米金刚石颗粒可成功负载氨氯地平，表明金刚石NP作为载体运输化学药物透过BBB具有一定的临床应用潜力。Shi等[18]在设计了靶向Angiopep-2(ANG)共轭聚(乙二醇)-b-聚(ε-己内酯)(APP)的NP，递送DOX以治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma，PCNSL)。相关研究数据表明，与对照组NP相比，靶向APP的NP被脑组织BCEC的摄取率显著增高。

2.2 FUS与MBs技术

2.2.1 FUS FUS可无创性地开放BBB。BBB通透性在一定范围内可被超声强度所影响，且高机械指数的体表超声会使其通透性提高。若超声强度适当，则可仅在超声辐照范围内开放BBB，而不影响脑稳态。研究[19]结果表明，FUS作为一种新型的功能性神经调节技术，具有脑组织靶向性，已被用于CNS疾病的评估和治疗。因FUS具有无创的优势，Fishman等[20]予特发性震颤患者行FUS消融治疗，效果优于有创的丘脑腹侧中核深部脑刺激疗法。美国FDA与欧洲药品管理局(European Medicines Agency，EMA)也已批准使用此项技术。

2.2.2 FUS联合MBs技术 FUS可通过空化效应、微环境的紊流剪切、声辐射力等作用暂时性地开放BBB[21-22]。其中，空化效应是指当FUS作用于液体中MBs时，MBs所产生的一系列动力学过程，包括振荡、膨胀、收缩，甚至内爆等。除此以外，声辐射力可使MBs移动、贴近血管内皮细胞表面并产生一系列生物学效应。虽然FUS联合MBs技术开放BBB已经得到实现，但其机制尚未明确。

Hynynen等[23]使用MBs造影剂来加强FUS无创性开放BBB的效果，结果表明，联合使用MBs与FUS技术，可使无创性开放BBB所需的超声强度大幅度降低，且在药物干预的24 h后BBB可以完全恢复正常。

张丽等[24]设立了多个对照组，研究不同MBs剂量和超声辐照参数对小鼠BBB的影响。通过优化参数、增加小鼠BBB的通透性，减轻对小鼠脑组织的损伤程度后发现，在合适的MBs剂量和超声辐照参数(MBs剂量1.0×107MBs，超声辐照参数0.8)条件下，诊断超声联合MBs能够无创、靶向地开放小鼠BBB。由此可见，FUS联合MBs技术开放BBB具备靶向性和可逆性的特点。

2.2.3 FUS联合MBs开放BBB的动物研究现状 由于FUS联合MBs可以靶向、无创、局部、可逆地开放BBB，因此目前已被应用于化学治疗、免疫治疗、基因治疗、干细胞治疗及提高相关组织药物浓度的动物研究中。

Treat等[25]以脑部接种了神经胶质肉瘤细胞的大鼠为模型，研究FUS对DOX的增效作用。研究结果证明，FUS可以增强颅内肿瘤的化学治疗效果。同时，该研究团队将另一种药物——氯化亚硝脲封装入MBs并进行动物实验发现，MBs不仅有效促进FUS诱导的BBB开放，同时可作为药物运输载体，保护药物免于快速降解。

张文竞等[26]应用低频FUS协同MBs促进人源性胶质细胞系源性神经营养因子(human glial cell line-derived neurotrophic factor, hGDNF)跨小鼠BBB，并建立其优化参数，评估技术优化后hGDNF经静脉注射跨小鼠BBB的可行性及安全性，结果发现，最优低频FUS Flash程序为辐照时长3 min、辐照时间间隔2s，造影剂Sonovue最适剂量为0.2 mL/25 g。最终证明应用低频FUS联合超声造影剂Sonovue可无创、定向、可逆、安全性地开放小鼠BBB，并实现和促进hGDNF跨越BBB。

亦有研究[27]结果显示，FUS联合MBs开放BBB可诱导海马神经发生，该发现有利于抑郁症的治疗。对模型大鼠进行每周1～3次不等的磁共振引导FUS开放BBB，结果发现，与未干预组比，接受每周2次治疗的大鼠显示出抗抑郁样作用，表明FUS有诱导短期抗抑郁的功效。这为情绪障碍治疗方法提供了新的选择。

2.2.4 FUS联合MBs开放BBB的局限 MBs的使用存在一定的局限性。首先，传统MBs直径为1～5 μm，大于细胞间隙(100～750 nm)，因而无法通过细胞间隙进入组织间质[28]。即使MBs体积能够小到通过弥散方式透过内皮间隙，MBs在体内的半衰期仅数分钟[29]，故聚集在靶区域的MBs数量将十分有限。此外，MBs过短的有效时间，加大了实验难度，提高了对操作者技术熟练度的要求。因此，有学者建议将NPDDS与FUS联合MBs技术相结合，以突破相关局限，促进药物透过BBB。

2.3 液气相变型纳米级载药体系 液气相变型纳米级载药体系(即相变型纳米粒)的出现给相关研究带来了转机，在一定程度上解决了FUS联合MBs的弊端。

全氟化碳(perfluorocarbon，PFC)是一种弥散度大、相对分子质量小、无毒、有生物化学惰性、高密度、高氧溶解能力的物质，在一定温度下呈液态，当达到一定温度或存在其他刺激时，会由液态转变为气态, 即液气相变(phase change/phase shift)。经足够能量的超声辐照后，PFC可在超声的空化效应与热效应作用下实现液气相变，即声学气化作用(acoustic droplet vaporization，ADV)。相变型NP便是一类以ADV为理论依据，以纳米级PFC液滴为内核，附以壳层材料的新型载药体系。研究[30-32]结果表明，相变型NP在血管外肿瘤显像、声控性释药等方面具有广泛的应用前景。研究者通过高速显微镜评估含八氟丙烷和十氟丁烷的纳米液滴在体外的相对蒸发效率，并利用其递送大小与蛋白质类似的分子(相对分子质量为40 000的葡聚糖)至C57BL/6小鼠脑组织后发现，纳米液滴的蒸发效率与穿过BBB的分子数量呈正相关。与十氟丁烷液滴相比，有更高蒸发效率的八氟丙烷液滴充当了更好的声学剂，可更有效地将大分子物质递送至大脑[33]。

就理论层面而言，在FUS的持续作用下，通过ADV形成的MBs仍然可以开放BBB。同时，NP因直径足够小而有机会通过开放的BBB进入脑实质，而脑实质的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR)能进一步促进NP在脑组织内的聚积[34-35]。以神经保护药物为例，若将其镶嵌在NP的壳层材料中，将具有生物靶向能力的配体修饰在NP壳层表面，那么NP便能在接触神经细胞时被特异性识别、吞噬。神经保护药物可随壳层材料的不断降解而被不断释放，从而实现在局部组织内持续释药，靶向保护受损的神经细胞。

3 总结与展望

BBB的存在给CNS相关疾病的治疗带来了诸多困难与限制。近几年，纳米材料的问世，为解决这一问题提供了技术突破。纳米材料的微体积特性使其具有穿过被短暂开放的BBB的能力，而构造两亲性的NPDDS为解决药物穿透BBB到达CNS，以及药物的缓释创造了条件。但截至目前，纳米材料在生物学方面的应用大多处于基础研究阶段， NPDDS的安全性、靶向性、有效性和可行性等问题仍缺乏一个衡量的金标准。同时，对于NPDDS在脑内的具体分布，其在循环系统中的代谢性能与毒性都尚未明确[36]。故纳米材料进入临床应用还有一段很长的路要走。因此，在基础研究水平进行NPDDS递药效率和生物安全性的研究就显得尤为迫切。

BBB对纳米材料制剂直径的要求较高[37]。FUS则为有效开放BBB创造了条件，协同MBs技术有效促进药物进入BBB，抵达CNS发挥作用。然而，随着研究的深入，MBs的局限性也逐渐显现，如传统MBs不具备跨细胞间隙进入组织间质的能力，在体内的半衰期时间短等。因此，当务之急就是寻找合适的纳米材料联合FUS，利用生物靶向(特异性结合LRP)和声控靶向(局部开放BBB)的双重效应，实现CNS相关药物在靶组织的有效释放，为CNS相关疾病的治疗提供新思路。