肺炎支原体疫苗研究进展

张海情 陈艳萍 张 瑾

1.湖南省儿童医院呼吸内科（湖南长沙 410007）；2.南华大学儿科学院(湖南长沙 410007)

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,MP）是社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的主要病原体之一，结构上分3层，分别为内外层的蛋白质层及中间层的脂质层，依赖与宿主细胞的紧密结合而生存，因此细胞膜一端向外延伸形成一种复杂而特殊的黏附细胞器来促进其寄生生存[1]。MP肺炎(Mycoplasma pneumoniaepneumonia，MPP)是由MP感染引起的肺部炎症，常引起呼吸系统症状，以发热、咳嗽为主要临床表现，可引起肺外系统的严重表现。MPP 在我国有较高的发病率，占儿童CAP的10%～40%[2]。大环内酯类抗生素是治疗MP 感染的首选药物。自2000 年以来，耐大环内酯类MP感染率在全球迅速增加[3]，以亚洲国家尤为严重，其中中国耐药率可达69%～95%[4]。因此，在合理使用抗生素的同时，需加大对新药的研发及新型预防措施的研究。

疫苗是预防与控制病原菌流行、感染及致病的最佳手段。自疫苗问世以来，多种疾病发病率明显降低。流感疫苗预防率可达59%[5]，儿童接种肺炎链球菌疫苗后可降低肺炎住院率[6]，新生儿期接种卡介苗，不仅可预防结核病，还可帮助新生儿免受其他非特异性感染[7]。由此可见，疫苗接种可有效阻断病原菌传播，降低人群感染和发病的风险。迄今为止，兽用MP疫苗已在国内外上市，并取得了良好的保护效果，而针对人的MP疫苗仍处于研发阶段。目前关注的重点主要集中于MP相关的亚单位疫苗、表位肽疫苗、DNA 疫苗及活载体疫苗等。本文就现有MP疫苗的研究现状进行综述。

1 全菌体疫苗

全菌体疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗，灭活疫苗又称死疫苗，是指利用理化方法将人工培养的完整的病原微物杀死，使其丧失感染性和毒性而保持免疫原性。减毒活疫苗是指病原体经过各种处理后发生变异，毒性减弱，但仍保留其免疫原性。接种后病原体可在机体内生长繁殖，引发机体免疫反应，从而获得长期或终生保护。灭活疫苗可诱导以体液免疫为主的免疫反应，它产生的抗体有中和、清除病原微生物及其产生的毒素的作用。

1.1 灭活疫苗

在一项关于MP 疫苗的保护效果和不良反应的meta分析中，作者对20世纪60～70年代开展的关于灭活肺炎支原体疫苗的保护效果及不良反应进行分析和总结，发现MP 灭活疫苗对MPP 的预防率维持在29%～74%，同时可使MP所致肺炎及呼吸道感染发病率下降40%[8]。然而Smith等[9]实验发现，MP灭活疫苗对免疫后能产生有效抗体的志愿者具有免疫保护作用，但可致免疫后未产生有效抗体者易感性增加，使MP灭活疫苗进一步研发受到了限制。

1.2 减毒活疫苗

减毒活疫苗可诱导体液和细胞两种免疫反应，部分制品可诱导黏膜免疫，使机体获得较广泛的免疫保护。减毒活疫苗通常由体外连续传代和/或温度敏感突变体产生。目前，MP减毒活疫苗已在动物实验中取得一定的成果，但由于其存在较大的安全隐患，因此至今尚未开展以人为对象的临床试验。

2 亚单位疫苗

亚单位疫苗是通过化学分解或有控制性的蛋白质水解方法，提取病原菌的特殊蛋白质结构，筛选出具有免疫活性的片段制成疫苗[10]。MP 的黏附细胞器分布有各种黏附蛋白，这些黏附辅助蛋白和黏附分子共同形成黏附复合物，宿主细胞的吸附能力取决于黏附蛋白的定位和蛋白质复合物组分之间的相互作用。P1、P30、P116 等蛋白作为黏附复合物的主要成分在MP的黏附和滑动过程中起了关键作用,这些蛋白的缺失及突变可导致MP黏附功能的丧失，滑动能力降低，形态和结构发生显著变化，是潜在的疫苗靶点[1]。

2.1 P1蛋白

P1蛋白是MP的主要黏附蛋白，由MPN141基因编码形成，主要附着于细胞器顶端，根据DNA 序列可分为1型(MP1)和2型(MP2)，它们具有不同的致病潜力。最新研究表明MP 2 株感染可能比MP 1株感染的毒性更强，更易引起神经系统及心血管系统疾病[11]，因此有学者推测基因分型对于未来疫苗的研究或许有至关重要的作用。

P 1 蛋白在MP 黏附、滑动过程中有重要作用，通过与呼吸道上皮细胞表面的唾液酸化寡糖受体结合，破坏气道黏膜的完整性，抑制纤毛运动、消耗上皮细胞周围的营养物质，进一步影响细胞代谢[12]，针对P1黏附素的抗体可以特异性地阻断MP与宿主的结合，并降低其滑动速度[13]。近来Widjaja等[14]研究发现了P 1 蛋白与宿主结合的新结构域，将P 1黏附素从17个切割位点形成22种不同蛋白质形态，模拟了不同蛋白质形态与纤溶酶原、纤维连接蛋白、肌动蛋白等宿主蛋白区域的结合，表明每一种蛋白质都保留了与宿主分子或其模拟结构结合的能力，可通过免疫机制诱导MP 的定植。另一方面，P 1 蛋白可在MP感染患者血清中检测到，研究表明P1蛋白C端具有高度免疫原性，并出现在各种抗MP重组疫苗中，是极具价值的疫苗候选抗原[15]。为了识别P1内被宿主体液免疫反应识别的区域，Schurwanz等[16]合成了15个跨P1分子的重组片段，一个在N端，两个跨越C端区域，将其暴露于MP感染患者的血清中，超过90%患者的血清具有强烈的免疫反应性。

P1蛋白作为目前最有潜力的疫苗候选抗原，有不少研究者对其进行了研究。贾飞勇等[17]研究用P1蛋白免疫动物小鼠后感染MP，发现免疫组支气管肺泡灌洗液sIgA明显高于未免疫组，且其肺炎支原体培养均为阴性；未免疫组出现肺炎的小鼠数远高于免疫组，且病变较免疫组重，这表明P1蛋白对MP感染有预防作用。Meng等[18]研究发现桔梗皂苷D可通过降低P1和P30蛋白的mRNA的表达来抑制MP对上皮细胞的黏附，以达到治疗和预防MPP的效果，虽然其为中药成分，但对于疫苗的研究有极大的参考价值。Kenri等[19]通过大肠杆菌表达系统获得了具有折叠结构的重组P1蛋白，其结构与生殖支原体P1蛋白的结构相似，此发现有助于P1蛋白结构、功能及抗体制备的研究。Drasbek等[20]研究发现P1蛋白可阻断MP对HEp-2细胞的黏附，从而使黏附在宿主细胞上的MP微菌落数量显著减少，发挥保护作用。朱翠明等[21]构建了重组P1C片段(rP1C)，发现其能黏附HeLa细胞，而抗-rP1C抗体可阻断MP对HeLa细胞的黏附，说明P1C具有良好的免疫原性和免疫反应性。Chourasia等[15]通过密码子优化技术将P1基因合成为4个不同的片段，并将其克隆在大肠杆菌系统中进行表达，结果发现在该P1基因多个位点均含有免疫优势区域，且针对N 端区域和C 端区域的抗体能阻止MP黏附，是潜在的疫苗靶点。

2.2 P30蛋白

P30是大小约为30-kDa的跨膜蛋白，位于MP黏附器的远端，具有免疫原性。P 30 参与MP 黏附、滑行运动，是MP 重要的毒力因子[22]。Schurwanz等[16]通过对MP P1和P30中的关键区域进行结合，获得了新型重组蛋白，并通过体外实验证明，针对该蛋白的抗体可显著减少MP 在人支气管上皮细胞的黏附率，具有减少甚至预防MP 在呼吸道定植的作用。Hausner等[23]利用嵌合重组蛋白HP14/30，将P1和P30表面定位、黏附相关的区域进行结合，通过鼻内接种方式免疫豚鼠。结果发现，重组疫苗可诱导豚鼠持久稳定的IgA相关免疫应答，且攻毒后，免疫组豚鼠MP特异性基因拷贝数量明显减少。

2.3 P116蛋白

P 116 是MP 重要的黏附素分子之一。在MP 致病过程中，P116同样具有免疫原性，可独立于其他两种黏附素P1、P30而发挥作用[24]。Svenstrup等[25]成功合成了P116特异性抗体，将其与MP进行反应，随后通过荧光显微镜观察MP 对HEp-2 细胞的黏附活动，结果发现抗P116特异性抗体可阻断MP对HEp-2细胞的黏附，发挥保护作用。

2.4 P1 -P40/P90

P1与作为辅助蛋白的P40、P90组成跨膜黏附复合体，在MP黏附过程中发挥重要作用。Vizarraga等[26]对P1、P40/P90结构进行分析，发现二者在胞外区整体结构及拓扑结构相似。另外针对P 1 C 端结构域产生的多克隆抗体可抑制MP 的黏附，同时P40/P90对MP感染后人血清也表现出强反应性，这也为将来MP疫苗的研发提供了新的思路。

2.5 MP559蛋白

Chen等[27]成功合成了P116N蛋白（P116的 N端跨膜蛋白）、P1C蛋白（P1的C端跨膜蛋白）、P30蛋白及嵌合蛋白P116N-P1C-P30(简称MP559)。用纯化的4 个蛋白分别免疫新西兰大白兔，通过ELISA法评估其免疫原性。结果表明，4种重组蛋白均能诱导较强的体液免疫应答，且MP559蛋白同时含有上述3种抗原表位，可作为疫苗候选抗原。

P 1、P 30 及其他黏附相关蛋白作为MP 黏附因子的重要组成部分，具有良好的免疫原性及免疫反应性，可诱导机体产生特异性中和抗体，是有希望在将来获得成功的疫苗靶点。但亚单位疫苗的研发仍面临着较多的挑战：①蛋白体外表达率低，且纯化过程较复杂；②与减毒疫苗及DNA 疫苗相比，亚单位疫苗无法进行自我复制，因此需要多次免疫；③当在不同的体系进行表达时，亚单位天然构象可能遭到破坏。这些都是在未来的研究中需要解决的问题。

3 表位肽疫苗

表位肽疫苗是用抗原表位氨基酸序列制备的疫苗，包括合成肽疫苗、重组表位疫苗及表位核酸疫苗，是目前研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向。Chen等[28]通过生物信息学技术对P1C T-B细胞表位进行分析，并合成了相应的表位肽疫苗。通过皮下注射方式免疫小鼠，随后用MP菌株进行攻毒，结果发现，P1C T-B表位肽(P1C103-117,P1C155-169,P1C224-238 及 P1C244-258) 可诱导小鼠体内产生高水平的IgG 及IgA 抗体。与对照组相比，表位肽疫苗组小鼠体内MP 定植量及炎性因子水平明显降低。Vilela Rodrigues等[29]基于比较基因组学和反向疫苗学，对88个MP基因组进行研究，发现了7种可用于疫苗研发的蛋白质。并对上述蛋白的氨基酸序列的B 细胞表位进行预测，发现这些表位能被免疫系统识别，从而诱导免疫应答。Unni等[10]通过免疫信息学技术，从MP 的12个膜相关蛋白、5个细胞黏附蛋白中筛选出3 个表位肽疫苗：WIHGLILLF、VILLFLLLF 及LLAWMLVLF。上述表位肽疫苗具有较多T 细胞、B 细胞表位，与HLA 分子亲和性高，可为机体在抗MP感染中提供良好的免疫保护效果。

表位肽疫苗在MP 感染中具有免疫保护效果，目前已在体外水平及动物水平中获得了成功，但尚无人体内相关实验数据支撑，仍需进一步深入研究。

4 CARDS毒素疫苗

社区获得性呼吸窘迫综合征（communityacquired respiratory distress syndrome，CARDS）毒素是由MP 产生的具有ADP-核糖基转移酶和细胞空泡化活性的外毒素，在MP致病过程中起重要作用。CARDS毒素首先与宿主细胞受体结合，通过内质网介导的途径被内化，然后运输到特定的细胞内，诱导特征性空泡化，最终引起细胞死亡[30]。在BALB/c小鼠模型中，小鼠感染MP后，其肺泡灌洗液和肺组织中可检测到CARDS 毒素，且浓度与MP 菌量、肺部炎症程度密切相关。同时急性期和恢复期MP 感染血清中均检测到CARDS 毒素抗体，而对照血清中CARDS 毒素抗体水平较低[31]。为了进一步研究CARDS毒素在人体内的免疫学特点，Kannan等[32]对9例MP感染患者急性期及恢复期体内抗CARDS抗体水平进行检测发现，在MP感染急性期，患者体内抗CARDS毒素抗体水平呈轻度升高，然而恢复期患者体内抗CARDS 毒素抗体水平显著升高。表明CARDS毒素具有较好的免疫原性。

动物水平及人体水平体外实验已证实MP 感染后抗CARDS 毒素抗体水平会显著上升，且有报道CARDS毒素的C端区域可诱导相应抗体产生[33]，表明减毒CARDS疫苗有望成为新的研究方向。

5 DNA疫苗

DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。与传统疫苗相比，DNA 疫苗结构简单，抗原相关表位比较稳定；其次，由于DNA 序列编码的病毒基因单一，基本没有毒性逆转的风险；同时，DNA 疫苗的生产、储存和运输成本低于传统疫苗。这使得MP DNA疫苗成了近年来研发的热点。Zhu等[34]将P1C与大肠杆菌不耐热毒素B亚基(LTB)进行融合，构建了LTB-P1C 融合DNA疫苗。通过鼻腔接种方式免疫BALB/c小鼠，结果发现，与对照组对比，接种融合DNA疫苗的小鼠抗MP抗体、IgA和IgG水平显著升高，表明LTB-P1C融合DNA疫苗能在小鼠抗MP感染中发挥免疫保护作用。

MP DNA疫苗优势在于毒性低、性质稳定、可同时诱导体液免疫应答及细胞免疫应答，但与传统疫苗相比，DNA 疫苗无法在哺乳动物体内持续复制，诱导的抗体水平较低，并且如何选择靶基因、如何控制免疫耐受、如何避免DNA与人类染色体异常结合并表达等，都是DNA疫苗的研发中亟待解决的问题。

6 其他疫苗

6.1 多糖疫苗

病原菌表面存在多种糖类物质，它们在识别、信号传递、黏附、感染及防御等方面发挥着重要作用。由于多糖的免疫原性，可将特异性的多糖纯化后制成多糖疫苗为机体提供免疫保护作用[35]。目前，已成功研制出肺炎球菌和脑膜炎球菌多糖疫苗，这为其他病原菌多糖疫苗的研究提供了参考。Brunner等[36]用MP 多糖疫苗免疫实验动物，发现MP 多糖疫苗可诱导免疫组动物产生特异性抗体。为了验证疫苗的保护效果，研究者对免疫组进行了攻毒实验，并于攻毒后10天进行检测，结果发现免疫组肺损伤病理评分和肺内活菌数量显著减少。

6.2 糖脂疫苗

MP 表面由富含抗原蛋白和糖脂的细胞膜所覆盖，MP表面糖脂已被证明在小鼠和人体内具有高度的免疫原性，是潜在的疫苗候选抗原[37]。目前认为，针对糖脂的免疫反应是由B-1a细胞等驱动，而布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)缺陷小鼠因缺乏B-1 a 细胞，无法进行由糖脂诱导的免疫应答反应。

为了评估抗糖脂抗体在MP 感染及免疫中的作用，研究者对MP感染后的小鼠血清进行了检测，并在其中检测到抗MP 蛋白抗体及抗MP 糖脂抗体。随后，研究者用MP感染Btk缺陷小鼠发现，感染后的Btk小鼠可产生抗MP蛋白的特异性IgG抗体，但无法产生抗MP 糖脂的特异性抗体。接着，通过对Bkt 缺陷小鼠及野生型小鼠肺部MP 清除率来评估小鼠感染后恢复情况，发现二者感染后恢复程度相当，表明针对蛋白质而非糖脂结构的抗体，在宿主抗MP感染发挥重要保护作用[38]。因此，以多糖、糖脂类为抗原的疫苗可能无法诱导机体产生持久的免疫应答，且分子拟态诱导的交叉反应性可引起多器官损伤，使得MP 多糖及糖脂疫苗的研发变得更为复杂。

6.3 活载体疫苗

活载体疫苗(live vector vaccine，LVV)是以细菌或病毒作为外源抗原和治疗因子的载体系统，将免疫原基因通过分子生物学技术重组到载体基因上，随后接种动物表达重组蛋白，以产生抗原，刺激特定的免疫反应。LVVs 所选择的多是无毒细菌菌株（如枯草芽孢杆菌），益生菌（如乳酸杆菌）或减毒菌株（如减毒李斯特菌）。LVVs 有其独特的优势，如安全性高，可长时间诱导机体产生体液及黏膜免疫，且可制成多价疫苗，是潜在的候选疫苗，也是目前最具发展潜力的基因工程疫苗之一。以减毒微生物，如沙门菌、李斯特菌、痘病毒和流感病毒作为活载体的疫苗现已广泛应用[39-41]。目前，尚无人用MP活载体疫苗问世，但已成功研发出针对猪MP的疫苗。

目前研究表明利用其他毒力因子（如多糖类、脂质类、糖脂类等）研发的疫苗可能无法诱导宿主产生持久的免疫保护作用，而且分子拟态效应可诱导免疫交叉反应，有进一步加重脏器损害的风险。LVV可诱导动物产生长时间的体液免疫及细胞免疫应答，然而LVVs 的研发同样存在着许多困难，如何使外源基因稳定表达、如何避免LVVs从减毒株转化成毒性株等都是在研发过程中需要解决的问题。

7 疫苗增强性疾病

疫苗增强性疾病(VED)常发生于接种疫苗后再次感染相应病原体。迄今为止，尚无人用MP疫苗问世，免疫后再次感染所引发的疫苗增强性疾病是原因之一。MP 缺乏细胞壁,其所引起的一系列炎症反应很大程度上是其细胞膜上脂质相关膜蛋白(lipidassociated membrane proteins，LAMP)所致，而脂蛋白是LAMP 中的主要成分。脂蛋白中的脂质成分具有免疫原性，在被Toll 样受体识别后可诱导机体分泌TNF-α、IL-6 及IL-1 β 等炎性因子。Mara 等[42]利用MP脂相关膜蛋白免疫BALB/c小鼠，随后用致病性MP菌株进行攻毒实验，结果发现，与对照组相比免疫后小鼠在MP定植量上无减少，且出现了严重的肺损伤。而在接种前去除LAMP 上的脂质部分可以消除上述情况。表明脂蛋白中的脂质部分是MP的VED 发生的原因。这为将来人用MP 疫苗研发提供了一定的借鉴。

总之，MP 在所有人群中普遍易感。近年来，对于MP 耐药菌株或多重耐药菌的感染率逐年上升，其临床治疗非常困难，因此研发MP疫苗迫在眉睫。目前，有多种MP疫苗正在研发中，包括全菌体疫苗、亚单位疫苗、表位肽疫苗及DNA 疫苗等。这些疫苗多通过鼻内免疫及皮下注射免疫。全菌体疫苗可被灭活或制成减毒活疫苗，其中灭活疫苗在免疫功能正常的患者中可诱导针对终端细胞器相关蛋白的特异性抗体产生，但对于免疫后未产生有效抗体的个体，当MP 再感染时，可出现严重的免疫损伤。以黏附因子为靶点的疫苗具有较好的免疫原性及免疫反应性，可通过阻止MP 对宿主呼吸道上皮的粘附发挥保护作用，但是由于蛋白体外表达率低、天然构象易遭到破坏，使其进一步研发受到了限制。MP本身无法诱导强烈的体液免疫应答，因此辅以佐剂（如铝佐剂）可能是未来一个新的研究方向。另外，LVVs目前尚处于研发阶段，其前景值得期待，并且以益生菌为表达载体的LVVs有望通过氧气雾化和/或口服方式进行免疫，这较传统的免疫方式有了极大的改进。当前，MP疫苗研究所面临的挑战主要包括以下两个方面：一是如何使疫苗诱发持久有效的免疫应答，并在保证免疫效果的同时提高疫苗的稳定性；另外，疫苗的安全性也是研发需要关注的重点，免疫后出现的疫苗增强性疾病可对宿主造成的不可逆的损害。综上所述，筛选更合适的疫苗靶点，研发新的免疫策略，将是今后研究的重点方向。相信随着研究的深入，在不久的将来MP 疫苗研发技术会更加成熟，新型疫苗也将更安全、高效、价廉。