畜禽产品中四环素类抗生素残留检测方法研究进展

苏 霞，王绪根，李 云，崔荣飞，冯腾垒，杨晓霞，赵金彩

（1.石家庄市畜产品和兽药饲料质量检测中心 050041；2. 行唐县畜牧工作总站 050000；3. 行唐县畜产品质量监测站 050000；4. 赵县农业农村局 050000）

四环素类抗生素具有广谱抗菌效应，对多种细菌具有较强的抗菌活性[1]，因此被广泛应用于畜禽养殖中，以此来促进畜禽动物生长、改善畜禽饲料利用率、降低动物死亡率等[2]。然而，由于部分从业人员缺乏职业道德素养，只顾追求经济利益，致使畜牧业中四环素类抗生素过度使用，导致食用畜禽产品中四环素类化合物的残留限量严重超标，严重影响人们的身体健康[3]，因此国内外都对畜禽产品中四环素类抗生素残留做了严格规定。为了遏制四环素类抗生素滥用现象, 2020年，我国农业农村部曾发布公告，禁止将包括土霉素、金霉素在内的药物用作饲料添加剂；在《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》中明确规定四环素、金霉素、多西环素和土霉素在畜产品中可以使用，但应制定最大残留限量的药物，牛/羊奶中的四环素类抗生素最大残留限量为100µg/kg，鸡蛋中四环素类化合物的最大残留限量为400µg/kg[4]。目前，畜禽产品中常用的检测四环素类抗生素残留的方法有高效液相色谱法（HPLC）[5]、免疫层析分析方法、气相色谱法（LC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS)等[6-10]。本文综述了目前针对畜禽产品中残留对四环素类化合物最新的检测方法，希望为今后的四环素残留检测提供方法依据。

1 气相色谱法-质谱联用法（GC-MS）

气相色谱-质谱联用法（GC- MS）同时具有气相色谱的高分辨率和质谱的高灵敏性的特点，可用于对难以区分的热稳定性好且易挥发的化合物进行分离确证，其可根据化合物分子的特征离子碎片，准确鉴定化合物，因此被广泛应用于畜禽产品中兽药残留检测。 但是气质联用法的缺点是无法分析高沸点、挥发性差、热稳定性差的化合物样品，尤其对大多数生化样品无法进行检测，就需要采取液相色谱法或其他分析方法进行前处理分析。

仓公敖等[11]利用气相色谱-质谱联用法，建立了一种对鸡肉、鸡 肝、牛肉、河蟹、鳗鱼及蜂蜜等畜禽产品中的土霉素、四环素的残留检测方法。该方法前处理过程中，将样品用异丙醇和乙酸乙酯（40 ∶60）进行分离提取，然后再经弱阳离子交换柱分离后，经气质联用仪分析确证，该方法回收率达到60%以上，检测限达到0.05～3.59 mg/kg之间，表明此方法具有较高的准确性和灵敏性。

2 液相色谱-质谱联用法

液相色谱- 质谱联用法（LC-MS）依靠液相色谱系统，将样品中复杂的化学组分进行分离，然后通过质谱系统检测特征分子离子峰，对样品中的化合物进行分析测定。该方法将液相色谱与质谱的优点相结合，具有特异性高、灵敏度高的特点，因此被广泛应用于药品、食品、医学等多种分析领域中。

刘柏林等[12]建立了一种同位素内标-超高效液相色谱-质谱联用法测定禽类产品中喹诺酮与四环素残留限量的检测方法，在该方法前处理过程中，采用Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液络合金属离子，并以钨酸钠与盐酸体系为沉淀剂，使样品基质中的蛋白质变性，从而除去基质中的蛋白质杂质，固相萃取柱净化，并将样品经液相色谱-质谱联用仪分析测定。采用多反应监测模式监测，同位素内标法定量，结果表明喹诺酮与四环素类抗生素药物残留在0.1～50.0 µg/L的浓度范围内线性良好，检出限为0.05～0.20 µg/kg，回收率达到60.6%～117.9%。该方法在前处理过程中降低了样品中待测物的损失，适用于批量测定畜禽产品中喹诺酮和四环素类抗生素。高志莹等[13]建立了一种利用超高效液相色谱-质谱联用法(UPLC-MS)同时测定牛奶中四环素类抗生素残留检测限量的方法，该方法将样品用EDTA-2Na-Mcllvaine缓冲液提取分离，然后经PLS固相萃取柱净化，最后用10%甲醇-乙酸乙酯洗脱，经液相色谱-质谱联用仪分析测定。该方法实现了在4min内可完成四环素类化合物的完全分离，方法灵敏度高，特异性好，方法回率达到81.5%～115.1%之间。张崇威等建立了利用液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋及牛奶中的四环素类化合物的检测方法，该方法样品基质用Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液提取，然后用装有脱脂棉的HLB固相萃取柱富集净化后，经液相色谱-质谱联用仪检测。该方法中四环素类抗生素在5～100 µg/kg范围内线性关系良好，方法检测限达到2µg/kg，定量限则为5µg/kg，方法回收率达到81.2%～110.0%之间。该方法所得的各项指标均符合残留检测标准要求，适用于鸡蛋及牛奶中四环素类抗生素残留限量测定。陈艳等[14]利用超高效液相色谱-串联质谱法对卤肉制品中的四环素进行残留检测，该方法中，四环素类抗生素在浓度0.1～10 µg/mL之间线性范围良好，线性相关系数在0.99以上。在3个不同浓度的加标回收下，该类化合物的平均回收率达到76.7%～103.7%，相对平均偏差则为3.2%～4.6%。抽取乐山地区部分市售食用畜产品，利用此方法测定里面的四环素类药物残留限量，结果表明该类化合物的残留含量均符合标准，表明该方法具有选择性好、灵敏度强的优点，可用于市售食用畜产品中四环素类药物含量测定。

3 高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）是将液体作为流动相，并结合高压输液泵，将具有不同极性的流动相泵入到色谱柱中，在色谱柱内利用各组分的极性不同，进行分离，最后进入检测器进行检测，从而实现对样品的分析。按其分离机制的可分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子对色谱法等，该方法灵敏度高、特异性强，因此被广泛应用于畜禽产品中各种兽药残留检测分析。

刘文静等[15]利用固相萃取-高效液相色谱法，实现了对乳品饮料中四环素类抗生素的残留检测。该方法中，前处理过程用乙腈沉淀样品蛋白，然后采用HLB固相萃取柱分离净化样品，以乙腈：甲醇：0.01mol/L草酸溶液（18∶5∶77）作为流动相，经高效液相色谱检测分析。该方法中，四环素类药物在0.10～1.00µg/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.994，检出限为2.0～5.0µg/kg，回收率在77.6 %～90.6 %，表明该方法选择性强、灵敏度高，适用于乳品中四环素类抗生素药物残留检测。李桂琴[16]等分别以HLB固相萃取柱、氨基柱和C18柱用于样品前处理过程中样品的分离富集，结果发现氨基柱对乳品的富集净化效果最理想，因此以氨基柱作为前处理净化柱，然后以0.1%甲酸-甲醇作为洗脱剂洗脱样品，以水乙腈（1∶4）为流动相，建立了利用超高效液相色谱法测定牛奶及奶制品中四环素类抗生素药物残留，结果表明该方法线性关系良好，准确度高。高旭东等[17]利用高效液相色谱法，实现了测定畜禽肉和三文鱼中的四环素类化合物的残留检测分析，该方法以Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液（pH=4.0）作为提取液，然后用三氯乙酸沉淀样品，经固相萃取柱富集净化待测样品，以0.01 mol/L草酸溶液∶乙腈∶甲醇（73∶17∶10）作为流动相。结果表明该类加标回收率达到74%～90%，相对标准偏差在3%～8%之间。表明该方法准确度高、灵敏度强，适用于检测畜禽产品中土霉素、四环素和金霉素药物残留。

4 免疫层析法

免疫分析法主要包括放射免疫测定法、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、金标检测试纸法等。免疫分析法操作简便、灵敏性高、适用于批量检测样品，被广泛应用于畜禽产品中四环素类抗生素残留检测。张正英等[18]用荧光免疫层析法，完成了对青海牦牛肉中四环素药物残留分析，该方法的定量限达到10µg/kg，样品回收率达到80.0%～120.0%，表明该方法准确度高、灵敏性强。此外，该方法中30 min内可完成样本的前处理工作，10min完成样品的定量检测。陈燕妮[19]等利用酶联免疫吸附测定法，建立了一种对牛奶和蜂蜜样品中四环素类抗生素残留检测方法。该方法中，该类化合物的加标回收率达到89.9%～105.1%之间，表明该方法准确度高、操作简便快速，适用于牛奶样品四环素类抗生物的药物残留检测。

5 小结

近年来，随着经济的不断发展，人们对食用畜产品的质量问题也越来越重视，因此需要开发高效、灵敏的畜禽产品中抗生素残留检测技术。本论文综述了针对检测畜禽产品中残留四环素类抗生素的研究进展，其中高效液相色谱法与液质联用法应用广泛，该方法高效、灵敏、稳定可靠，但具有前处理复杂、操作难等缺点，因此检测四环素类化合物的方法还需进一步研发，以保障人民的食品安全。