牛卵母细胞体外成熟存在的问题及可能的解决方法

徐 华，邢宝奎，朱 捷

（1.廊坊市农业农村局，河北 廊坊 065000；2.廊坊市六骥生物技术开发有限公司，河北 廊坊 065000）

1978年世界上第一个“试管女婴”路易丝·布朗（Louise Brown）在英国出生。小路易丝的诞生标志着哺乳动物体外受精（in vitrofertilization，IVF）技术已经成熟。辅助生殖技术（包括IVF技术）为动物和人类生殖生物学增添了新的内容，也为无数不孕不育夫妻带来“福音”。由于这项技术在动物生殖生物学的基础研究成果在治疗不孕不育及动物育种中表现出极大的应用前景，此项技术在后来的10年里有了较快发展，特别是在大家畜IVF技术方面，1981—1986年间通过体外受精技术生产的试管牛［1］、试管猪［2］、试管绵羊［2］及试管山羊［3］相继获得成功。遗憾的是所有这些成功案例采用的卵子全部来自体内成熟的卵母细胞。可见这时的IVF技术是真正意义上的IVF。随着该项技术研究不断深入及技术的发展，IVF技术的内涵也发生了很大改变，已经发展成为集卵母细胞体外成熟（in vitromaturation，IVM）、成熟卵母细胞IVF和胚胎体外培养（embryoin vitroculture，IVC）三项技术于一体的综合技术体系。到1990年前，主要家畜的IVF体系基本建立。由于牛特殊的经济价值及IVF技术在品种改良上的巨大潜力，其IVF技术在所有家畜中发展最快、水平最高，并迅速在生产中得到了广泛应用。2017年，全球体外生产（in vitroembryo production，IVP）的牛胚胎移植数首次超过了体内回收胚胎移植数，其中60%以上是鲜胚移植，冷冻体外胚胎由于移植成功率偏低致使其占比相对较少［4］。这些数据仅仅是国际胚胎移植协会发布的统计数据，而实际数据可能还要高。这也标志着牛胚胎体外生产技术已经进入规模化商业应用阶段。近20年来在世界范围内已累计进行了超过1 600万次牛胚胎移植［5］。目前，全世界每年生产约100万枚IVP牛胚胎，其中约1万枚为性控胚胎。另外在提高单头优秀母牛繁殖效率方面，牛活体采卵（ovum pick-up，OPU）结合体外受精和胚胎移植技术（OPU-IVF-ET）正在取代传统的超数排卵和胚胎移植技术（MOET），展现出广阔的应用前景。例如，在美国综合育种值排名前100名的奶用种公牛中，有87头是通过OPU-IVF-ET技术产生的。回顾30多年来牛IVF技术的发展，在一些方面取得了进展，如激素和各种添加因子在体外成熟体系中的应用、无血清培养体系或无动物产品培养体系的建立；但遗憾的是IVF生产效率并没有明显提高，如卵母细胞的体外成熟率仍然保持在80%～90%，受精后48 h分裂率为70%～80%，囊胚率为30% ～40%，囊胚率极少超过50%。这些结果被认为是目前的国际先进水平，几乎与30年前相同。这意味着超过50%的体外成熟卵母细胞在受精后无法正常发育。这已成为制约牛OPU-IVF-ET技术普及应用的最大障碍，而IVF技术的难点正是卵母细胞的体外成熟［5］。因此，文章将着重围绕牛卵母细胞体外成熟中遇到的主要问题（即卵母细胞核与细胞质不同期成熟、卵母细胞群中每个卵母细胞发育阶段不同期及表观遗传学的变化）进行论述，并提出可能的解决办法。

1 卵母细胞细胞核与细胞质成熟不同期

无论是OPU采集，还是通过屠宰厂卵巢得到，从离开卵泡时开始，卵母细胞核成熟就失去了卵泡液中一些抑制因子的调控，其细胞周期重新恢复，从而产生了卵母细胞核成熟超前而细胞质成熟滞后的情况，即“卵母细胞核与细胞质成熟不同期”的问题。这样的卵母细胞要么无法受精，要么因为卵母细胞质量差导致受精后发育停滞。另外，成熟卵母细胞质量的好坏不仅直接影响受精率和发育率，而且直接影响多精入卵现象的发生。与体内成熟的卵母细胞相比，体外成熟的卵母细胞受精后多精入卵的发生率要远远高于前者。显然，这种卵母细胞核与细胞质成熟的不同期会随着采卵人员技术不熟练或卵母细胞离开卵泡到进入卵母细胞体外成熟培养系统时间的延长而加剧。因此，抑制卵母细胞核成熟速度、缩小卵母细胞核成熟与细胞质成熟不同期化的程度，是在体外成熟培养过程中获得高质量成熟卵母细胞的关键。

牛卵母细胞体外成熟培养中存在的细胞核与细胞质成熟不同期的问题是长期以来研究人员一直关注并努力解决的问题。要解决这个问题，最直接的方法是模拟卵母细胞体内发育过程，详细了解不同发育阶段卵泡内环境条件的变化规律，从而找到有效解决办法。在这方面研究人员已经取得了一些成果。在卵泡内部卵母细胞和周围的颗粒细胞通过间隙连接和卵泡液（follicular fluid，FF）传递的因子不断相互作用，使卵母细胞获得发育能力。这些相互作用是卵母细胞分化成功的决定性因素。目前已经在卵泡液中发现许多化合物，包括由颗粒细胞或卵母细胞本身分泌的生长因子［6］及包括外泌体（exosomes）在内的细胞外载体（extracellular vehicles，EV）［7］，这些细胞载体来源于体细胞和卵母细胞，其中包括蛋白质、mRNA、microRNA和脂质［8］。这些外泌体参与保护卵母细胞免受过氧化物的损害［9］，以及microRNA信号传导、诱导早期胚胎中的转录调节［10］和调节卵丘扩张［11］等作用。总之，对外泌体的进一步研究可能会改善胚胎体外生产效率［12］，并有助于确定卵母细胞质量的标志物。卵泡液中含有众多已知和未知的因子，在不改变其他条件的情况下，直接利用卵泡液取代体外成熟培养液中的犊牛血清，可显著改善牛卵母细胞体外成熟效率［13］。卵泡液的主要作用可能是促进了卵母细胞在体外成熟过程中细胞核和细胞质成熟的同期化。但卵泡液中各种因子的含量和活性易受诸多因素影响而发生变化，很难做到在牛卵母细胞的IVM中精确添加。因此，研究人员希望通过调节卵母细胞的细胞周期，降低其细胞核成熟速度或提高细胞质成熟速度，使卵母细胞核与细胞质达到同期（或同步）成熟。目前比较理想的办法是在卵母细胞离开卵泡后立即抑制或停止卵母细胞的细胞周期，使卵母细胞的细胞核与细胞质在IVM前接近同期化，之后再进入IVM液开始体外培养过程。自1990年以来，在不同畜种上开展了大量试验研究，并有许多相关文章发表［14-17］。调控卵母细胞细胞周期的抑制因子主要有放线菌酮（cycloheximide，CHX，一种蛋白质合成抑制剂）［18］、卵母细胞成熟促进因子激酶活性的抑制剂（roscovitine，ROS）［19］、6-二甲基氨基嘌呤（6-dimethylaminopurine，一种磷酸化抑制剂）［17，20-22］、蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂（vanadate，即NaV03）［20］、侵入性细胞外腺苷酸环化酶（iAC）、磷酸二酯酶抑制剂（PDE inhibitor）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）［23-24］和丁内酯Ⅰ（ButyrolactoneⅠ，一种核成熟抑制剂）［14，25］。以上这些抑制因子都通过不同途径对卵母细胞的细胞周期产生抑制或停滞作用。而当这些因子的抑制或停滞作用被取消后卵母细胞的细胞周期又可以重新恢复，而且绝大多数的抑制剂并不影响卵母细胞正常成熟。但这些试验的结果并不总是有效的。R.D.Rose等［26］将从屠宰厂卵巢获得的羊卵母细胞-颗粒细胞复合体在正常IVM培养之前，用含有100 mmol／L的Forskolin（FSK）加500 mmol／L的3-isobutyl-1-methylxanthine（IBMX）溶液处理卵母细胞-颗粒细胞复合体2 h，卵母细胞与颗粒细胞复合体的cAMP浓度提高了10倍。并且IVF后囊胚率和胚胎质量获得显著提高。此外，Milrinone是一种3型磷酸二酯酶的特异性抑制剂，只在卵母细胞中表达；而Rolipram是一种4型磷酸二酯酶的特异性抑制剂，只在颗粒细胞中表达。如果将这两种抑制剂同时加入成熟培养液中，囊胚率也会明显提高。这说明上述抑制剂不仅抑制卵母细胞的细胞周期，而且抑制颗粒细胞的细胞周期，这对卵母细胞成熟是非常有利且必要的。同样，添加cAMP调节剂或其他类似试剂到成熟培养液中也可以改善卵母细胞成熟效率和质量［15，27-29］，或者至少对卵母细胞发育潜力无不利影响［14，29-30］。另外，IVM的卵母细胞与体内成熟的卵母细胞相比，除了质量上的差异以外，还有一个显著缺点就是最佳受精时间短，一般仅为2～3 h（如果卵母细胞成熟质量不好，时间可能更短），而体内成熟的卵母细胞最佳受精时间可达4～6 h，甚至更长。因此，延长IVM卵母细胞最佳受精时间不仅可以提高卵母细胞成熟质量和数量，同时也能让一些接近老化的卵母细胞延缓老化，使更多的卵母细胞可以被受精，进而提高IVF效率。从理论上讲，凡是可以维持或提高卵母细胞中成熟促进因子（maturation promoting factor，MPF）的药物都应该是潜在的候选药物。筛选出适宜的抑制剂，并优化其使用浓度和处理时间是非常重要的。

综上所述，采用特异性抑制剂去停滞或延迟卵母细胞核成熟的速度或加速卵母细胞质成熟的速度，使细胞核与细胞质的成熟同期化，有可能成为未来提高体外成熟卵母细胞质量的一个有效途径。

2 卵母细胞群中每个卵母细胞发育阶段不同期

IVF技术的最大优势就是可以高效利用优秀母畜卵巢上的卵母细胞资源，充分发挥繁殖潜力和遗传优势。但牛是单胎动物，无论是通过活体采卵、还是通过屠宰厂卵巢获得的卵母细胞，在进行体外成熟培养时各自处于不同的发育阶段，这种现象称为群体卵母细胞发育阶段的不同期。当采集的卵母细胞进行正常的体外成熟培养后（一般22～24 h）通常可以得到以下类型的卵母细胞：（1）死的或闭锁的卵母细胞；（2）没有成熟的卵母细胞；（3）老化的成熟卵母细胞；（4）细胞核成熟而细胞质未成熟的卵母细胞；（5）细胞核和细胞质都成熟的卵母细胞。其中，只有第5种类型的卵母细胞是真正具有发育潜力的合格细胞。另外，除了死的卵母细胞，有经验的技术人员可以通过形态学观察加以剔除，而其他很难通过形态学加以区分。群体卵母细胞发育阶段的不同期是造成牛体外受精效率在过去30多年中没有明显提高的最主要原因。为什么不同的技术人员处理同一批卵母细胞会得到不同的结果？究其原因，具备熟练操作经验的技术人员是关键，一是这类人员动作熟练、操作速度快，可以显著缩短卵母细胞离开卵泡后进入体外成熟培养系统的时间。二是他们对采集卵母细胞的质量判断和形态学选择更加准确。因此，对初学者进行必要的培训是快速提高操作人员技术水平的必由之路［8］。

与让单个卵母细胞核与细胞质成熟同期化相比，欲使从屠宰厂采集的卵巢或活体采卵收集的卵母细胞群体中所有或绝大多数卵母细胞发育期达到同期化要相对更难些。前已述及，不仅卵母细胞的细胞周期需要同期化，而且附着在卵母细胞周围的颗粒细胞也需要同期化，这对卵母细胞群体的同期化至关重要。而颗粒细胞的细胞周期一般为22～24 h。这也意味着与卵母细胞核成熟被抑制或停滞相比，卵母细胞群体的同期化可能需要更长时间。一般认为群体卵母细胞的成熟不可能同时到达成熟（即第二次减数分裂的中期MⅡ）。通过汇总分析卵母细胞到达成熟的时间和数量等数据，可以得到卵母细胞的成熟率曲线，一般呈左半正态分布的状态，这是目前衡量IVM卵母细胞成熟的一项重要指标。当成熟率曲线分布越广，表明卵母细胞群中处于不同期状态的卵母细胞数量越多，预示IVF效率越低；相反，当成熟率曲线分布范围越小，则说明卵母细胞群中到达成熟的时间比较集中、同期化程度较高，预示会有更多的卵母细胞可在最佳时间内得以受精。因此，IVM卵母细胞成熟率曲线是提高卵母细胞体外成熟率的关键，也是决定动物体外胚胎生产效率最主要的因素之一。如何提高卵母细胞群体成熟率，同步、集中卵母细胞群体成熟时间，是目前全世界牛IVF技术领域面临的共同挑战。比较理想的解决思路就是设法让所有的卵母细胞在IVM之前，像“百米短跑比赛”一样，能够“站在”同一起跑线上，即让卵母细胞在进入IVM培养前处于同一发育阶段，不允许其停滞在原来的自然发育阶段。这样经过同样时间的IVM培养，就会有更多的卵母细胞共同发育、成熟到较为集中、统一的最佳受精时间，为后续受精和胚胎发育奠定物质基础［9］。有研究者采用蛋白合成抑制剂放线菌酮或丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶抑制剂6-二甲基氨基嘌呤处理卵母细胞24 h，以避免卵母细胞核的成熟［31］。他们发现几乎所有被处理过的牛卵母细胞都停止在GⅤ期，表明抑制剂的作用是有效的。当抑制剂被移除后，这些卵母细胞可以正常成熟和受精。采用放线菌酮处理后体外成熟的牛卵母细胞，经过体外受精及胚胎培养，囊胚率略低于未经抑制剂处理并在体外成熟22 h后的卵母细胞再进行体外受精的对照组，但高于26 h受精的对照组；不过，放线菌酮处理48 h后卵母细胞可以正常成熟与受精，但没有囊胚出现。而6-二甲基氨基嘌呤处理后的牛卵母细胞，尽管后续可发育至囊胚，但囊胚率低于未经药物处理的对照组，同时也低于放线菌酮处理组。同时，在含有放线菌酮的溶液中添加促卵泡素（FSH）＋17β-雌二醇（estradiol-17β，E2）或只添加17β-雌二醇处理，受精后的囊胚率与对照组没有差异。更重要的是，将经过放线菌酮处理24 h的卵母细胞进行体外受精后得到的胚胎进行受体移植，最终获得2头健康牛犊。这表明采用放线菌酮处理24 h的卵母细胞可以产生正常胚胎，且这些胚胎具有发育成动物个体的潜力。这为广大研究人员打开了“新的窗口”，提供了解决问题的新思路。按照这个思路，笔者正在进行中的试验取得的初步结果（尚未发表）表明，与对照组相比，对卵母细胞群体进行同期化处理组的卵母细胞成熟率及受精48 h后的分裂率、囊胚率、胚胎质量都有显著提高。随着对卵母细胞体内发育过程的生理机制更为深入的研究和了解，加强对卵母细胞体外发育调控方法的创新和持续优化，相信在不久的将来，这个长期困扰牛卵母细胞IVM的问题一定可以得到圆满解决。

3 表观遗传学的变化

众所周知，卵母细胞在体内生长环境和体外成熟培养环境有着很大的不同。其中最大的不同是，体内生长环境是一个动态的自主调控系统，即按照卵母细胞生长需求，机体不断提供相应营养物质和调控因子，通过下丘脑-垂体-性腺轴的负反馈和正反馈调控机制调节卵母细胞生长、发育、成熟和排卵所必需的生殖激素［11］。而体外培养环境是一个固定态，让卵母细胞-颗粒细胞复合体在一个人为模拟体内环境的条件下培养24 h。这个复合体需要在这个固定态的培养体系中进行新陈代谢，溶液中被消耗的营养物质和激素无法得到及时补充和更换，加上代谢产物也无法及时排出，这种双重作用会直接导致卵母细胞-颗粒细胞复合体在发育成熟过程中的一些基因表达发生异常，从而使卵母细胞的成熟偏离正常的发育轨迹。因此，把这种卵母细胞基因本身没有变化、但因环境因素改变而导致基因表达发生改变视为表观遗传的变化。例如，小鼠受精卵在Whitten培养液中培养至囊胚阶段，与体内的同期囊胚相比，有114个基因表达出现异常；而同样的小鼠受精卵培养在KSOM＋氨基酸的溶液中，仅发现有29个基因表达出现异常［32］。由此可见，不同培养液对胚胎细胞发育的影响非常大。另外，由于采用卵母细胞-颗粒细胞复合体体外成熟培养，在细胞发育过成程中产生的各种代谢产物无法及时清除，造成一些有毒、有害代谢产物的积累，进而对卵母细胞的成熟产生不良影响，其中代谢产生的过氧化物对卵母细胞或胚胎的毒害作用是研究人员应特别关注的问题。另一方面，血清和氨基酸代谢产生的氨对细胞也有毒害作用，常导致胚胎在着床前印记基因的表达丧失或异常，这被认为是导致牛羊出现“大胎儿综合征（large offspring syndrome，LOS）的主要原因。大约10% 的体外生产胚胎在移植后可能出现“大胎儿综合症”［33］。因此，目前的卵母细胞体外培养体系与机体自身卵泡内成熟系统相比，远没有达到理想条件。这也说明改善牛卵母细胞的IVM仍然有很大提升空间。

目前，绝大多数已发表的有关动物卵母细胞体外成熟的文章都属于表观遗传变化范畴，归纳起来主要包括：（1）营养物质或代谢对卵母细胞成熟的影响。例如溶液成分［34-35］、氨基酸［36］、脂肪因子［37］、氧气与葡萄糖［38］、茴香脑［39］、DMSO［40］、叶酸［41］等。（2）各种激素、生长因子（包括旁激素对卵母细胞成熟的影响）。例如雌激素［42］、上皮生长因子（EGF）和透明质酸［43］、前列腺素［44］、促卵泡素（FSH）［45］、L-半胱氨酸、骨形态发生蛋白-15（BMP15）和生长分 化 因 子 -9（GDF9）［46］、白 血 病 抑 制 因 子（LIF）［47-48］等。（3）抗氧化剂或缓解代谢毒素对卵母细胞成熟的影响。例如褪黑色素（melatonin）［49-50］、番茄红素（lycopene）［51］、诺比列汀（Nobiletin）［52］等。尽管类似的探索试验还有很多，但绝大多数结果与试验条件有很大的关系。有些试验结果报道有效，但有些试验结果是不可重复的。

4 小结和展望

与其他很多学科和技术相比，IVF技术仍然非常年轻。从IVF包括IVM建立以来，只在短短的30年时间里，这项技术不仅累计产生了近千万的“试管婴儿”，为许多不孕不育家庭解除了痛苦、带来了欢乐，而且正在或将在提高家畜生产率和改良动物育种效率上发挥越来越重要的作用。近两年，国内以牛IVF技术为基础的生物技术公司不断涌现，标志着IVF技术已经初步具备了商业化生产的条件和基础。随着国内动物育种（特别是牛育种）的发展和日益增长的市场需求，我国牛IVF技术也将迎来一个重要的发展机遇期。同时应该看到，目前国内体外受精技术水平与国际相比，无论是在科研还是在生产应用上都存在很大差距。一方面我们深切感到将现代动物繁殖生物新技术应用到动物育种上的紧迫感，另一方面又面临着相关技术瓶颈的限制。因此，加快牛IVF技术由研究转向应用，必须从关键技术层面解决好主要瓶颈问题。尽管到目前为止，牛IVF技术研究涉及的相关因素至少有上百种，但在本文中仅简要归纳为三类，其中前两项最为重要，也是难度最大的。这是多年来笔者在IVF科研实践与推广应用中收获的体会。

生产效率是一项技术转化为生产力的生命线，没有生产效率的技术是失败技术。因此，需要广大科研和推广工作人员立足实际，通过联合研发、集成协作、实验示范，着力解决IVF技术中存在的主要问题，力争使我国早日进入到该技术世界先进水平，为牛OPU-IVF-ET技术在我国牛育种中快速、高效应用奠定扎实的技术基础和平台。