特异性促炎症消退介质在眼表疾病中的研究进展

贺李娴，谭 钢

0引言

多不饱和脂肪酸是哺乳动物细胞膜的主要成分，包括花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)与二十二碳五烯酸(docopentaenoic acid，DPA)。这些多不饱和脂肪酸可被环氧合酶(cyclooxygenase，COX)、脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)和单加氧酶(CYP450)代谢分解为一系列具有高度生物活性的含氧脂质介质，在炎症过程中发挥限制炎症强度、促进炎症消退的作用。这类能够调控炎症消退反应介质被统称为内源性特异性脂质(specialized pro-resolving mediators，SPM)。至今已发现的SPM主要包括脂氧素(lipoxin，LX)、消退素(resolvin，RvE)、保护素(protectin)及Maresins(MaR)四大家族。多不饱和脂肪酸衍生的SPM通过与特定的G蛋白偶联受体结合，调控细胞因子和趋化因子的释放，限制免疫细胞浸润与激活，从而促进炎症的消退，使机体恢复稳态，共同构成内源性SPM网络[1-2]。研究表明，SPM在维持眼表健康与免疫稳态方面起着关键的作用[3-5]。此外，SPM及其类似物还参与角膜伤口愈合、角膜移植排斥反应、过敏性结膜炎、感染性角膜炎及干眼(dry eye disease, DED)等一系列眼表疾病的发病过程，成为调节眼表免疫反应、消除急性炎症、促进角膜伤口愈合与神经再生的关键信号分子与药物治疗靶点[6-11]。本文将集中阐述SPM对于维持眼表稳态的重要性及SPM在多种眼表疾病中的治疗潜力。

1内源性SPM网络在眼表组织和细胞的表达

1984年，Serhan等[12]首次报道了SPM家族中的第1个成员脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)，之后Gronert等[13]于2005年在角膜表面鉴定出脂氧素A4(LXA4)与神经保护素D1(neuroprotectin D1, NPD1)，并证实角膜上皮细胞是健康角膜内源性SPM的主要来源，而角膜上皮缺损则出现LXA4和NPD1在角膜组织的表达缺失，表明LXA4和NPD1等内源性SPM在维持眼表健康与角膜的完整性方面起重要作用。

已经证实，产生SPM的酶在角膜上皮细胞和免疫细胞中高度表达。SPM的产生大多依赖于LOX酶，有三种主要的LOX酶(5-LOX、15-LOX和12-LOX)。其中，5-LOX和15-LOX催化多不饱和脂肪酸底物的氧化反应从而生成一系列SPM。体内大多数部位的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞都高度表达5-LOX。眼部的几种细胞(如视网膜星形胶质细胞、间充质基质细胞与角膜上皮细胞等)均存在5-LOX的表达[14-15]。其中，角膜上皮细胞和视网膜星形胶质细胞同时表达5-LOX和15-LOX酶[13]。

同时，SPM的特异性受体(如LXA4、RvD1和RvE1的受体)表达于眼表微环境中常驻或浸润的细胞表面，包括上皮细胞、杯状细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和效应性T细胞[16-18]。LXA4(AA衍生而来)和RvD1(DHA衍生而来)两者拥有相同的受体FPR2/ALX，在健康的角膜、结膜和视网膜以及淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞中都有表达[16-17]。RvE1(EPA衍生而来)尚未在动物或人的眼表或泪液中发现，但发现其受体ChemR23在角膜上皮细胞、角膜基质细胞和浸润的白细胞中有表达[18]。保护素、Maresins(DHA和DPA衍生而来)对应的G-蛋白偶联受体在小鼠和人类的其他部位有表达，有学者推测这些受体可能由眼表局部或浸润的淋巴细胞和中心粒细胞所表达。

2 SPM在维持眼表健康与免疫稳态中的作用

眼表微环境中适度的炎症反应与免疫稳态对于维持视功能和保护视力具有重要作用。眼表微环境中不同的组织细胞成分(角膜、结膜和泪腺等组织细胞)在维持眼表健康方面发挥着各自独特的作用，而一旦细胞功能异常或失调则会导致持续的眼表炎症，对眼表组织造成炎性损伤，最终导致视力丧失。SPM作为眼表炎症反应控制与消退的关键信号分子，参与了角膜上皮再生、角膜损伤后血管生成、泪液产生等关键病理生理过程。

2.1角膜上皮再生角膜上皮再生是维持眼表稳态的重要机制。角膜缘干细胞通过向心迁移至角膜中心来代替脱落的角膜上皮细胞。当角膜上皮受损时，位于角膜之外的中性粒细胞会在几小时内渗透到角膜基质中，参与角膜伤口的正常修复过程。而在角膜上皮擦伤的动物模型中，预先清除中性粒细胞则显著延迟了角膜上皮的再上皮化和伤口愈合[13,19]。研究发现，雌性小鼠和雌二醇处理的雄性小鼠的角膜伤口愈合延迟，可能与雌激素抑制LXA4的生成而下调角膜中性粒细胞反应和再上皮化有关[20]。局部使用LXA4可促进女性患者角膜的伤口愈合，同时接受雌二醇治疗亦有利于男性患者角膜伤口的恢复与愈合[20]。这些研究表明，急性角膜创伤愈合反应的性别差异可能与角膜SPM的作用有关。

2.2角膜损伤后新生血管生成角膜内源性LXA4在调节角膜损伤后新生血管生成中具有重要作用。内源性5-LOX和15-LOX是LXA4合成的关键酶。在慢性眼部炎症模型中，5-LOX或15-LOX的基因缺失可促进角膜新生血管化，表明角膜内源性LXA4参与调节炎症新生血管生成，局部使用LXA4治疗LOX基因敲除小鼠可减轻小鼠角膜的新生血管生成[21]。此外，在缝线法诱导的角膜新生血管小鼠模型中，LXA4类似物ATLa与消退素(RvD1与RvE1)也可抑制角膜的新生血管生成[16,21]。

2.3泪液产生泪液分泌是维持眼表健康的关键环节。健康志愿者的泪液中有大量的SPM及其前体被检出[22]。研究者利用脂质代谢组学，在12名健康志愿者的泪液中检测到了较高浓度的AA衍生脂质(LXA4、15-epi LXA4、前列腺素PG)以及DHA衍生脂质(RvD1、RvD2和RvD5)[22]。在小鼠模型中，泪腺可以产生大量的LXA4[23]，但目前尚不能明确泪液中SPM的组织和细胞来源(包括角膜上皮细胞、泪腺、睑板腺或结膜等)。

3 SPM在眼表疾病的治疗作用

3.1角膜伤口愈合角膜组织持续暴露于外界环境中，易受到各种理化因素的刺激与伤害。在眼外伤、某些合并疾病(糖尿病等)及接受眼部手术(LASIK屈光手术和角膜移植等)的人群，角膜擦伤的发生率更高，角膜伤口的愈合与治疗一直是困扰临床眼科医生的难题。多项体外模型研究表明，SPM治疗对角膜上皮细胞产生直接的保护作用，能促进角膜上皮细胞的伤口愈合。在人角膜上皮细胞体外划痕实验中，Zhang等[6]发现消退素RvE1可以促进角膜上皮层的伤口愈合，其保护效应可能与表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)密切相关；Wang等[20]研究亦表明脂氧素LXA4可促进了角膜上皮细胞的迁移，并逆转雌二醇导致的角膜炎症与再上皮化延迟。同样在兔角膜上皮细胞，研究证实表皮生长因子可诱导脂氧素LXA4产生，进而促进兔角膜上皮细胞的增殖、迁移与愈合。

多项动物模型证实，SPM在角膜伤口愈合过程中起关键性作用。角膜损伤后，中性粒细胞是第一批渗入角膜基质的效应细胞。由于中性粒细胞高表达5-LOX，因此能够扩增或启动多个SPM的形成，在调节下游免疫反应与后续炎症消退过程中发挥重要作用。研究表明，中性粒细胞对角膜伤口的正常愈合至关重要。在角膜热灼伤和角膜上皮剥离等急性角膜擦伤小鼠模型，眼表局部应用脂氧素LXA4或神经保护素NPD1滴眼液可显著增加中性粒细胞的浸润，促进角膜伤口愈合[13]。Wang等[20]发现雌性小鼠角膜上皮伤口愈合延迟，与角膜上皮中脂氧素合成酶15-LOX的低表达及脂氧素LXA4形成减少有关，而LXA4滴眼则显著改善雌二醇导致的角膜上皮伤口愈合延迟，表明角膜伤口愈合的性别差异与雌二醇对上皮内中性粒细胞15-LOX/LXA脂质回路的的选择性调节有关。除中性粒细胞外，角膜上皮损伤期间大量的嗜酸性粒细胞亦被募集到角膜组织中。Ogawa等[24]研究发现，与野生型小鼠相比，嗜酸性粒细胞缺乏的小鼠与嗜酸性粒细胞12/15-LOX条件性敲除的小鼠均出现角膜伤口愈合延迟，表明嗜酸性粒细胞表达的12/15-LOX脂质回路与角膜损伤修复密切相关。此外，角膜上皮细胞表达LXA4、RvD1和RvE1等对应的G-蛋白偶联受体(FPR2/ALX和ChemR23)[16]，然而还需要进一步的研究来确定调控角膜上皮细胞迁移、增殖的分子机制和信号转导途径。

3.2角膜神经再生角膜是人体内神经分布最多的组织，而角膜神经则是维持眼表健康与微环境稳态的关键成分之一。在某些病理情况下(衰老、糖尿病眼病、黄斑变性、DED及屈光手术等)，角膜神经病变往往导致角膜感觉受损、疼痛敏感度降低、角膜感染风险增加、伤口愈合延迟甚至角膜溃疡穿孔。最近在视网膜神经节细胞和原代皮层神经元中发现了SPM受体(ALX/FPR2)，表明SPM可以与神经细胞直接作用[14]。多项动物实验表明，神经保护素NPD1具有促进角膜神经再生的作用对大脑和视网膜具有神经保护作用[13]。NPD1局部滴眼还可促进小鼠屈光手术后及兔板层角膜切除术后角膜和基质神经损伤的神经再生[25]。色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor，PEDF)是一种作用广泛的分泌蛋白，具有抗新生血管、神经营养及神经保护功能。近年来研究发现，PEDF可由受损的角膜上皮细胞通过自分泌途径产生，PEDF能刺激DHA的生成，继而通过15-LOX促进NPD1的生物合成。研究发现，在板层角膜切除术后，联合应用PEDF和DHA滴眼可刺激NPD1的产生，增加神经密度并促进角膜上皮细胞的增殖。在糖尿病小鼠模型中，PEDF和DHA联合治疗可显著增加角膜损伤后的角膜神经再生、敏感性和泪液分泌量，还并通过选择性募集2型巨噬细胞至伤口周围来加速角膜伤口愈合[26]。单独应用消退素RvD1通过作用其受体FPR2/ALX途径刺激糖尿病小鼠角膜神经生长[27]。Pham等[8]报道了衍生于DHA的新型RvD6立体异构体RvD6si滴眼液可通过调节三叉神经的基因表达(上调转录组Rictor、mTORC2等与轴突生长相关转录基因的表达，下调与神经病理性疼痛相关转录基因的表达)，从而促进损伤后的角膜神经再生与角膜伤口愈合和功能恢复，减轻眼神经病理性疼痛。因此，这些研究为DHA来源的SPM网络作为治疗角膜糖尿病神经病变和刺激神经再生的潜在局部疗法提供了充足的证据。以上研究表明，NPD1、RvD1等SPM可以促进基质和角膜神经损伤后的神经再生，然而SPM如何促进神经再生和功能活性的分子机制有待进一步研究。

3.3角膜移植排斥反应角膜移植术是治疗终末期角膜疾病的常用方式，虽然角膜移植的成功率较其它器官移植高，但是术后排斥仍然是手术失败的主要原因。即使积极使用抗排斥药物干预，临床上仍可见大量移植后排斥病例。移植受体角膜植床的微环境改变，如角膜炎症刺激及新生血管化等，都成为角膜移植排斥的危险因素，术后排斥几率达到50%。有证据表明，SPM预处理可以提高供体角膜保存期间移植物活性，从而减少移植物排斥反应的发生率。He等[7]改良了人角膜供体移植物的保存方法，发现移植物在脂氧素衍生物15-epi LXA4的DMEM/F-12培养液预先保存过夜(然后再转移至Optisol-GS角膜保存液)，与安慰剂对照组相比，移植物存活率提高了36%～56%，同时移植物角膜上皮细胞的增殖活性增加了近3倍。在小鼠角膜移植模型，Hua等[17]发现在移植后即刻和移植后7d静脉注射消退素RvD1a(1μg/mL)，可显著降低受体T细胞的同种异体致敏反应，抑制移植物T细胞浸润及炎性血管生成，从而提高了移植物的存活率。尽管体内体外实验均证实SPM具有抑制同种异体免疫反应、提高移植物存活率的潜力，但尚需更多的临床与基础研究进一步证实其保护作用。

3.4结膜炎结膜炎是一种常见的眼表疾病，其病因包括病毒或细菌感染、过敏或自身免疫性因素。在过敏性结膜炎中，杯状细胞功能异常和黏蛋白分泌失调与结膜炎眼部病理损伤密切相关；而结膜黏蛋白的分泌又与肥大细胞脱颗粒后组胺刺激杯状细胞内的钙离子释放有关。研究表明，SPM具有维持正常黏蛋白分泌稳态的功能。体外研究表明，在大鼠和人结膜杯状细胞中，多种SPM(包括LXA4、RvD1、RvD2和RvE1)，可以下调组胺触发的钙信号及其他信号通路，抑制黏蛋白分泌[28-29]。此外，结膜杯状细胞表达LXA4/RvD1的受体(FPR2/ALX)和RvE1的受体(ChemR23)受体[30]。动物实验亦表明，SPM局部滴眼可显著改善卵清蛋白诱导的小鼠过敏性结膜炎症状，如减少杯状细胞黏蛋白分泌、降低结膜免疫细胞(CD4+T细胞、CD11b+髓样细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞与单核细胞等)的数量[9]。在病毒性结膜炎小鼠模型中，发现眼睑结膜中存在脂氧合酶5-LOX的高表达，而5-LOX抑制剂抑制半胱氨酰白三烯的分泌并减轻结膜病理损伤[31]。

3.5感染性角膜炎SPM在治疗眼表病原体感染性疾病方面具有积极的作用。相比传统的抗生素或免疫抑制剂治疗，SPM作为一种治疗眼部感染的新途径，可抑制白细胞的黏附、迁移与激活，增强巨噬细胞对细菌和凋亡的中性粒细胞的吞噬作用，促进眼表抗菌肽的形成，从而减轻破坏性感染性炎症、防止角膜混浊和瘢痕形成、提高局部抗生素疗效和增强眼表天然免疫防御能力。SPM已被证明能减少病毒感染后的眼表损伤。单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染会导致角膜知觉受损，严重时会导致角膜溃疡、融化和穿孔。局部应用RvE1类似物(RX-10005)可显著减少角膜中T细胞和中性粒细胞的浸润抑制，从而抑制HSV-1感染后角膜新生血管的形成、减轻基质角膜炎，改善病毒感染后的角膜病理损伤[10]。铜绿假单胞菌是一种临床上常见的条件致病菌，也是配戴隐形眼镜及眼科术后细菌性角膜炎的常见致病菌。眼部铜绿假单胞菌感染可诱导强烈的角膜上皮炎性反应和PGE2的释放，从而导致眼表的永久性损伤。在细菌脂多糖或灭活的铜绿假单胞菌诱导的小鼠细菌性角膜炎模型，在造模前后局部应用RvE1可减轻角膜基质厚度，抑制局部中性粒细胞的浸润以及细胞因子(CXCL1、肿瘤坏死因子α和白细胞介素-1β等)的生成[10]；局部应用LXA4可抑制角膜中性粒细胞浸润与CXCL1水平从而缓解角膜炎症，同时促进角膜上皮的伤口愈合，增加83%的再上皮化[32]。表明SPM作为辅助治疗可以潜在地抑制眼部微生物感染的病原性炎症，同时还可促进组织再生。

3.6DED DED是一种多因素疾病，目前全球约有2000万人罹患DED，也是当前最常见的眼表疾病之一。DED的病因很广，危害较大，可引起眼睛不适、疲劳和视力障碍，严重影响工作效率和生活质量，甚至可因发生角膜溃疡或瘢痕致盲，给个人以及社会带来巨大的负担。大量的动物实验表明，SPM或内源性SPM系统在免疫驱动的DED中具有保护作用，是治疗DED的行之有效的方法[23,33-34]。在东莨胆碱联合干燥通风诱导的经典小鼠DED模型，消退素RvE1的类似物(RX-10001)滴眼预处理可降低DED小鼠角膜通透性，维持杯状细胞的密度[33]，还可增加了泪液分泌量，促进了角膜上皮屏障完整性，降低COX-2的表达，并抑制了CD4+T细胞和巨噬细胞的浸润[34]。LXA4的下调与雌性小鼠DED的发生密切相关。最近的一项研究发现，DHA饮食不足3mo既可显著加重雌鼠DED症状，而补充DHA可改善DHA缺乏饮食的雌性DED症状，其机制与DHA上调Treg细胞的数量，减少引流淋巴结中Th1和Th17效应细胞有关[23]。同时，DHA还可上调引流淋巴结和角膜缘中性粒细胞15-LOX的表达，导致局部LXA4水平升高；而位于引流淋巴结的中性粒细胞数量减少和LXA4形成障碍已被证实为一种性别特异性反应，参与T效应细胞功能反应并导致雌性小鼠DED[11]。由此可见，性别特异性的淋巴结LXA4回路的下调与雌性DED的扩增有关。在小鼠干燥综合征相关的DED模型中，RvD1全身用药可减轻局部炎症细胞的渗出，改善小鼠的唾液分泌功能[35]。除了眼表疾病外，RvE1和RvE1类似物(RX-10001)在其他器官系统疾病中的保护作用也得到广泛证实[36]。近年来，RX-10045作为眼科药物的安全性和有效性，在DED、白内障手术后的眼表炎症的局部治疗亦得到证实[37]。

泪液中的SPM还有望成为DED的生物标志物。研究发现，人体泪液中亦存在SPM。English等[22]利用脂质组学在健康志愿者的泪液中检测到了较高浓度的脂氧素(LXA4、15-epi LXA4)与消退素(RvD1、RvD2和RvD5)。同时在男性志愿者的泪液中消退素浓度更高，而脂氧素(LXA4和15-epi LXA4)在女性眼泪中表达更为丰富，表明SPM在泪液的表达存在一定的性别差异。然而，当前有关DED泪液中SPM检测分析的报道尚不多，但SPM在DED疾病诊断生物标志物方面仍具有一定的潜力。

4前景与展望

SPM与眼表健康和免疫稳态息息相关，且在眼表疾病中的治疗价值日益凸显，SPM及其类似物在调节眼表免疫反应、促进眼表炎症消退、促进角膜伤口愈合与神经再生等方面，展示出广阔的应用前景。目前已开发了以SPM的结构类似物用于DED的临床治疗，但较真正投入临床应用还要克服诸多挑战，仍需要大规模多中心的临床试验来佐证。未来我们期待更多的SPM新成员或生物活性稳定的类似物，从内源性抗炎症消退机制角度来来解释眼表疾病的发病机制，应用于常见眼表疾病(尤其角膜创伤、眼表感染及DED等)的治疗中。