骨髓间充质干细胞外泌体中miRNA在视网膜新生血管形成中的作用及机制

张 璐，王雅芬，叶亚婷，白 倩，郭长梅

0引言

视网膜血管疾病如早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity, ROP)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)和视网膜静脉阻塞等以异常增生的视网膜新生血管为主要病理表现。在该类病变中，均有不同程度的视网膜血管损害导致的血管闭塞，进一步引起视网膜缺血而促进异常视网膜新生血管(retinal neovascularization, RNV)的增生[1]。RNV异常的细胞组成损害血视网膜屏障，血管的脆性增加易导致视网膜出血、渗出、玻璃体腔出血甚至纤维血管增殖牵拉致视网膜脱离，使视力恶化甚至丧失[2]。现多以激光光凝、抗血管内皮生长因子药物或手术治疗[3]，但均有不同程度的限制性和并发症。近年来有研究表明，骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)通过旁分泌作用释放的外泌体(exosomes, Exo)可有效降低氧诱导视网膜病变模型小鼠(oxygen-induced retinopathy, OIR)视网膜缺血的严重程度。本文阐明了BMSCs及其衍生Exo-miRNA对RNV形成的作用及机制。

1骨髓间充质干细胞和外泌体及外泌体源性miRNA概述

1.1骨髓间充质干细胞概述间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种来源于骨髓、脂肪、脐带和胎盘组织，以炎症分解、伤口愈合和维持具有高异质性的内稳态而闻名的祖细胞[4]，具有塑性黏附性和多谱系分化特性，而且还能表达特定的表面标记[5]。被认为在疾病治疗方面极具潜力，但近来研究表明，玻璃体腔内直接注射MSCs可能诱导正常和病变视网膜的血管扩张、白内障和视网膜炎症反应，这表明使用干细胞治疗视网膜疾病存在一定风险[6]。然而其旁分泌效应产生的营养和免疫抑制因子等，能够通过血视网膜屏障而无明显免疫、炎症反应，可以作为葡萄膜炎、青光眼、视网膜和眼表疾病细胞治疗的新型治疗药物[7]。因此，在新生血管性视网膜疾病中，BMSCs对损伤视网膜的旁分泌营养效应可能是一种比直接细胞治疗视网膜功能障碍更安全有效的方法[8]。

1.2外泌体概述Exo是细胞内多囊泡体与细胞膜融合后释放到胞外基质中，以旁分泌等途径到达受体细胞，通过细胞表面结合蛋白或膜融合传递物质的一类直径约为30～100nm的膜性囊泡[9-10]。其来源和分布广泛，可由多种细胞所分泌。Exo的内容物丰富，含有细胞因子、蛋白、RNA、miRNA和脂质等，参与了如免疫应答、细胞间通讯、蛋白质和RNA转运等多种生理过程，是一种重要的细胞间物质和信息交流的工具[11-12]。

1.3外泌体源性miRNA概述MicroRNA是一种小分子量单链非编码RNA，可以通过抑制mRNA翻译或促进mRNA降解来下调靶基因的表达，作为负性调节蛋白质编码基因而促进生理和病理血管生成[13-14]。Exo对疾病的作用与miRNA有着密切的关系。心肌缺血等疾病中，BMSCs分泌包含有miR-125b的Exo可通过靶向SIRT7途径保护心肌细胞以免受缺血再灌注损伤[15]。卵巢疾病中，携带有miR-644-5p的BMSCs-Exo通过靶细胞的p53来改善卵泡形态、抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，对卵巢功能早衰恢复卵巢功能具有潜在治疗效果[16]。同样，Exo在眼部疾病中的作用与miRNA的重要关系也已被证实。青光眼中，BMSCs衍生的Exo对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell, RGC)及轴突的神经保护作用，正是通过Exo成功地将多种miRNA递送到视网膜内层，与效应分子Argonaute-2相互作用促进RGC的存活及其轴突的再生[17]。

已有研究表明，肿瘤细胞的Exo能够调控免疫功能、促进肿瘤血管新生和侵袭而参与肿瘤的发生、发展和转移[18-19]。由于肿瘤形成发展过程伴随着含miRNA的Exo向胞外基质的释放，并且在所有的生物体液中几乎均可发现由各类细胞衍生的Exo，使它们作为微创性液体活检的一种方式极具吸引力[20]。如体循环Exo-miR-21升高与胶质细胞瘤、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌和食管癌有关，尿源性Exo-miR-21升高与膀胱癌和前列腺癌有关[21]。因此，对体液中Exo及Exo-miRNA的检测将为肿瘤的临床诊断和预后评估提供新的方式[22]。与肿瘤类似，新生血管性视网膜疾病中，也有血管异常增生的现象，且在眼部疾病中，Exo及Exo-miRNA越来越被认为是调节视觉系统中细胞间通信的重要因子，并且现在正作为生物标志物、治疗剂和药物递送载体被广泛探索[23]。

由于目前眼科研究中，视网膜新生血管形成相关研究大多以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)作为视网膜内皮细胞的替代，故本文通过介绍BMSCs来源Exo-miRNA对HUVECs的作用，说明在视网膜血管疾病中可能的作用及机制。

2 BMSCs调控新生血管形成的作用及机制

2.1BMSCs直接调控新生血管形成既往已有研究证实BMSCs释放血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、IL-6等血管生长因子来促进新生血管形成[24]。对比骨髓和人胎盘来源MSCs条件培养基中的血管生长因子，可见BMSCs来源培养基中，VEGF、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBP2和IGFBP6的水平明显较高[25]。Hou等[26]已证明了BMSCs在眼内对脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)病变所产生的影响，缺氧诱导miR-188-5p的降低直接上调基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶13(MMP-13)的表达促进BMSCs等骨髓来源干细胞向CNV病变发生处迁移，从而促进了脉络膜中病理性新生血管的形成而增加CNV病变的严重程度。

2.2巨噬细胞介导BMSCs调控新生血管形成BMSCs还可在巨噬细胞的介导下促进新生血管形成。BMSCs可在M2型巨噬细胞通过VEGF和趋化因子基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)等细胞因子介导下发生动员、迁移并募集至缺氧的视网膜中，进一步分化为血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等血管细胞及结缔组织细胞促进新生血管形成，而参与RNV的形成[27-28]。

去除OIR小鼠模型玻璃体内的巨噬细胞可减缓RNV病变程度，表明缺血缺氧引发的病理性新生血管与巨噬细胞的聚集有关[29]。OIR小鼠模型中，在该过程中起主要作用的色素上皮衍生因子(PEDF)是一种天然的病理性血管生成抑制剂，通过调节MAPKs的磷酸化来介导巨噬细胞的极化。MAPKs的激活影响M2型巨噬细胞极化，而Notch1途径影响M1型巨噬细胞极化，虽然M1和M2型巨噬细胞在体内外均可促进新生血管形成，但与HUVECs的共培养中，M2型巨噬细胞在促进细胞增殖中更具潜力[30]。对比M1和M2型巨噬细胞与人视网膜内皮细胞共培养后对内皮细胞的增殖程度和管腔形成的提高效果，可见M2型巨噬细胞增加的程度更为显著[31]。

除自身促进血管生成的效应外，M2型巨噬细胞还可在缺氧条件下促进BMSCs的迁移和分化。将BMSCs注射入心肌中，邻近BMSCs的巨噬细胞表现出M2标记物精氨酸酶-1(Arg1)的强表达。体外实验BMSCs共培养骨髓源性巨噬细胞，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等M1标志物明显减少，Arg1等M2标志物显著增加[32]。用M2型巨噬细胞的培养基培养BMSCs，可检测到SDF-1、CXCR4、VEGF和MMP-9的表达增高，表明M2型巨噬细胞通过SDF-1/CXCR4信号通路在促进BMSCs的迁移分化，进而促进新生血管形成的过程中发挥重要作用。

3 BMSCs-Exo调控新生血管形成的作用及机制

近年来研究表明，在心血管疾病中，内皮细胞功能改变在疾病发展不同阶段起关键作用[33]。该进程由BMSCs通过旁分泌释放Exo调控，BMSCs-Exo在体外促进HUVECs的管腔形成，而且在心肌梗死小鼠模型中，也具有增强心脏血管密度和募集心脏祖细胞能力[34]。另外，BMSCs-Exo可通过调控miR-494等miRNA的含量增强血管生成[35]。

Bian等[36]发现缺氧刺激下BMSCs可释放细胞外囊泡，迅速被HUVECs摄取，能够以剂量依赖性的方式促进HUVECs的增殖、迁移和管腔形成。体外模拟外周动脉疾病，MSCs释放Exo的剂量与新生血管形成之间形成剂量依赖关系，当浓度最高达到100ng/mL时促血管生成能力降低[37]。其机制与NF-κB信号通路有关，NF-κB信号通路可调节细胞生长分化和存活发育，是重要的血管生成调节通路[38]。在抑制了NF-κB信号通路之后Exo诱导管腔形成的能力显著下降，证明了NF-κB信号通路在Exo介导的新生血管形成中的重要作用，且该作用具有显著的剂量依赖效应[37]。

4 BMSCs来源Exo-miRNA调控新生血管形成的作用及机制

4.1Exo-miRNA促进新生血管形成的作用及机制Gong等[39]学者的研究发现MSCs-Exo可促进HUVECs管腔结构的形成。在抑制Exo中miR-30b的表达后，血管生成的能力显著降低。这证明了MSCs通过释放Exo将miR-30b、miR-30c、miR-424、let-7f转移至内皮细胞来动员内皮细胞增殖、迁移和形态改变而促进血管生成。此外，MSCs-Exo所包含的生长因子、细胞因子和趋化因子也可能参与血管生成。

新生血管性视网膜疾病主要改变是病理性增生的RNV，RNV的形成与缺氧有密不可分的关系。在缺氧环境中，会产生更多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)来介导缺氧诱导的细胞反应，当ROS的产生超过内源性抗氧化剂的能力时，就会发生氧化应激[40]。检测缺氧刺激后的OIR小鼠视网膜可见ROS的大量积累，组织缺氧和ROS使得VEGF-A和缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)表达明显增加而介导新生血管的形成[41]。HIF-1α在100多个基因的转录控制中起关键作用，这些基因调控血管生成、葡萄糖和能量代谢、红细胞生成、细胞增殖和活力等功能[42]。Sun等[43]将HIF-1α过表达的BMSCs-Exo与缺氧处理的HUVECs共培养，可显著提高新生血管管腔的长度和数量。

Zhu等[34]对BMSCs缺氧处理诱导细胞中HIF-1α升高，升高的HIF-1α通过直接调控中性鞘磷脂酶-2(nSMase2)的表达使其较常氧环境下显著增加，增强BMSCs-Exo释放及囊泡活性，而上调Exo-miR-210含量，进而提高HUVECs中VEGF含量以促进血管生成，增强血管内皮细胞的管腔形成能力及心脏保护作用。这可能是由于HIF-1α调控异质性胞核核糖核蛋白(hnRNPs)的表达，使得miR-210通过与RNA结合蛋白结合形成复合物呈hnRNPs依赖性途径运输到Exo中，以保持稳定性并发挥生物合成及信息交换等关键作用[44-45]。另一方面，HIF-1α通过结合鞘磷脂磷酸二酯酶3(SMPD3)基因启动子序列中假定的缺氧反应元件(HREs)导致下游靶点nSMase2表达增加了神经酰胺的产生，进一步促进包含有miR-210的Exo装载释放[34]。

其中，Exo随旁分泌到达靶细胞后通过与特定表面蛋白的受体结合，触发融合作用而直接与质膜融合，或由靶细胞内吞作用将其内容物释放到目标细胞质中[9]。BMSCs-Exo中所含的Jagged1作为关键参与者介导该过程。Jagged1是Notch信号的配体，随HIF-1α升高而在细胞与BMSCs-Exo中均有显著升高，通过介导HUVECs中Notch信号靶基因HES1和HEY2的表达促进血管形成[46]。

王雅芬等[47]收集缺氧条件下的BMSCs条件培养基，与视网膜脉络膜组合细胞(RF/6A)共培养后检测细胞的迁移能力和管腔形成能力，均可见明显提升。也就是说BMSCs对RF/6A可起到相同的促进内皮细胞迁移和管腔形成作用，该作用通过BMSCs的条件培养基产生，说明很可能同样由Exo及其中的miRNA介导，故进一步探索Exo-miRNA在RNV和CNV形成中的作用及机制具有重要意义。

4.2Exo-miRNA抑制新生血管形成的作用及机制Exo-miRNA不仅可以促进RNV形成参与视网膜血管疾病的发生发展过程，还可以抑制RNV形成对该类疾病起治疗效果。如在DR中，高糖诱导内皮细胞中ROS增加发生氧化应激，继之视网膜微血管内皮细胞损伤而RNV形成是DR的病理生理学表现之一[48]。此过程中可检测到视网膜Müller细胞中的VEGF等促进新生血管形成相关因子增加。Li等[49]检测DR视网膜细胞中各项指标的变化情况，发现miR-486-3p的表达量显著降低以及TLR4、NF-κB的表达量显著上调。miR-486-3p具有抗氧化应激，减少ROS的作用，在肿瘤细胞、2型糖尿病、PM2.5导致的肺泡上皮细胞损伤中均有所降低[50-52]。TLR4、NF-κB则与抑制视网膜内皮细胞氧化应激及炎症相关，TLR4在伴随微血管并发症的糖尿病患者单核细胞中表达增高[53]。将BMSCs来源的Exo-miR-486-3p与Müller细胞共培养后，VEGF等促血管形成相关因子的表达量有所下降，从而抑制了高糖环境中视网膜新生血管的形成。同时，miR-486-3p可通过TLR4/NF-κB信号通路减少氧化应激造成的细胞损伤[49]。由此可见，BMSCs来源Exo-miRNA不仅在疾病的发生中起作用，还可在视网膜血管疾病的治疗中发挥积极效应。

5小结与展望

Exo作为一种性质较为稳定的物质，其易保存和运输的特性极大提升了在治疗等领域的应用价值。近期Yao等[54]为拓宽Exo在心肌缺血治疗方面的应用，开创了一种内含Exo的微创喷雾制剂来在最大限度保留Exo生物功能的基础上避免开胸手术等创伤性治疗方式，达到增强心脏功能，减少心肌梗死面积的疗效。同样，在眼科疾病的诊断与治疗过程中，Exo及Exo来源miRNA与角膜损伤、DR、青光眼和葡萄膜黑色素瘤等疾病存在密切关系[55-56]。Moisseive等[57]将BMSCs-Exo注射入OIR小鼠玻璃体腔，可显著减缓视网膜缺血严重程度和视网膜新生血管的发展，而无炎症及免疫反应的发生。这与部分体外实验中BMSCs-Exo对内皮细胞的作用相反，可能与其所处的微环境相关。因此，本文简要概述BMSCs来源Exo-miRNA在RNV形成的发病机制中所起的作用及机制，有利于为全面认识其应用方式以及潜在治疗效果提供帮助。故进一步探索BMSCs-Exo在RNV和CNV等新生血管性眼病中的作用及机制，以及不同作用效果产生的微环境及条件对于BMSCs-Exo以安全、有效的方式运用于临床实践具有重要的意义。