m6A甲基化修饰在头颈鳞癌中的研究进展

赵原锋 任贵云

头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是一种常见的恶性肿瘤，2020年全球发病率约为4.6%。随着基础及临床研究的进一步深入，头颈鳞癌的治疗手段较以前更加丰富，但5年生存率仍有待提高。这主要是由于大多数头颈鳞癌患者早期没有明显的临床症状，且此癌种易发生早期转移，患者确诊时往往已至中晚期。因此临床上迫切需要一种新的早期诊断、治疗靶点。随着遗传学的研究，有别于传统遗传学的表观遗传逐渐被人们所重视，表观遗传是指在不改变DNA核苷酸序列的情况下引起基因表达的可遗传性改变，其与生命发展的各个过程都息息相关[1]。自20世纪70年代末期在信使RNA（messenger RNA，mRNA）中发现了N6-甲基腺苷（N6-Methyladenosine，m6A甲基化），RNA甲基化的研究便逐渐成为研究的热点，有研究发现m6A作为真核细胞最常见的RNA甲基化，参与了许多的生物学进程，包括mRNA的稳定、剪切、出核及翻译效率等[2]。现已证明，多种肿瘤m6A甲基化水平较对照组有显著差异，并且m6A甲基化可以直接或间接调控肿瘤的增殖、侵袭、转移等一系列生物学进程[3]。本文旨在简述m6A甲基化对常见恶性肿瘤多种表型的影响以及目前头颈鳞癌中m6A甲基化的研究进展。

一、m6A甲基化修饰关键酶

m6A修饰是指RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上发生的甲基化。近些年，随着检测手段的发展，m6A的研究逐渐成为表观遗传学的热点，目前针对m6A甲基化的研究主要集中于mRNA。大量研究表明m6A甲基化特异性的富集于终止密码子和3’端非编码区的固定片段中（RRACH）。除此之外，其他类型RNA同样存在m6A甲基化的身影。作为真核细胞RNA上最常见的甲基化修饰，m6A甲基化参与了细胞的多种生物学行为，这是一个高度特异性、动态的、可逆的生物学过程，并涉及三类酶：甲基化转移蛋白（writer）、去甲基化蛋白（eraser）和识别蛋白（reader）。

1.甲基化转移蛋白（writer）

在mRNA中，大部分的m6A甲基化修饰是由甲基腺苷甲基转移酶3（N6-methyladenosine methyltransferase3，METTL3）和甲基腺苷甲基转移酶14（N6-methyladenosine methyltransferase14，METTL14）组成的多亚基复合物以高度特异性的方式添加到序列中，少量的m6A甲基化修饰由甲基腺苷甲基转移酶16（N6-methyladenosine methyltransferase16，METTL16）催化形成。目前多认为METTL3和METTL14为甲基化转移蛋白的核心蛋白。但是METTL3和METTL14在甲基化过程中的具体交互机制尚不明确，现主要认为METTL3和METTL14共同组成二聚体，其中METTL14是METTL3的变构活化剂，单独的METTL14不具备催化能力[4]。但也有人发现，敲除METTL3后，细胞的m6A甲基化修饰仍然存在[5]。而甲基化过程中的特异性主要在于维尔姆肿瘤1相关蛋白（Wilms’tumour 1-associating protein，WTAP为METTL3-METTL14二聚体提供“定位”服务，使二聚体在细胞核内特异性的识别RRACH序列并发挥功能。

2.去甲基化蛋白（eraser）

目前发现的去甲基化蛋白酶主要为肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）和AlkB同源蛋白5（AlkBhomologue5，ALKBH5），两者之间有较远的同源性，其中FTO是首个发现的m6A去甲基化酶。但FTO特异性较差，其与N6,2＇-O-二 甲 基 腺 苷（N6,2＇-O-dimethyladenosine，m6Am）修饰的反应速率是其与m6A甲基化修饰的100倍，并发现FTO可能通过影响小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）的m6Am甲基化修饰，调控剪切过程[6]。ALKBH5是第二个发现的m6A去甲基化酶，与FTO不同，ALKBH5与m6Am甲基化修饰无反应，特异性较好。其主要存在于细胞核中，暗示其主要在核内调控RNA的生物学过程[7]。

3.识别蛋白（reader）

m6A甲基化修饰对mRNA的影响主要是通过识别蛋白（reader）来实现，分为直接阅读器和间接阅读器。目前的研究主要集中于前者，包括含有YTH结构域的蛋白家族、METTL3和真核翻译起始因子3（eukaryotic translation initiation factor 3，eIF3），YTH家族蛋白主要分为YTH结构域蛋白（YTH domain-containing protein，YTHDC）1/2、YTH结构域同源蛋白（YTH domain-containing family protein，YTHDF）1/2/3五种，其中DC1位于细胞核，而DF1/2/3位于细胞质，DC2既可位于细胞核也可位于细胞质[8]。研究发现他们的功能各不相同：DC1优先结合非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）中的m6A位点，并影响mRNA的剪切与出核；DC2和DF3影响mRNA翻译与降解；DF1优先结合细胞质中mRNA的m6A位点并促进mRNA的翻译；DF2可以通过p结构促进mRNA的降解；METTL3可以和eIF3在细胞质中与mRNA 5＇UTR中m6A位点结合促进mRNA翻译效率[9]。

而间接阅读器，通过一种被称作“m6A开关”的机制影响目的RNA的生物学功能[10]，即m6A甲基化程度高的RNA结构上更趋向于线性，更利于RNA结合蛋白结合，导致间接阅读器被动地募集到RNA附近并与之结合，参与调控RNA的剪切、出核等过程，包括异质性胞核核糖核蛋白C（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C，HNRNPC）和新发现的胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein，IGF2BP）家族，其中HNRNPC优先结合ncRNA，并可能与mRNA上的m6A结合影响其剪切[11]；IGF2BP家族同m6A结合力较弱，结合后可以增加m6A mRNAs的稳定性[12]。

二、m6A甲基化对肿瘤多种表型的影响

上皮间质转化是指上皮细胞失去极性和细胞间连接向间质细胞转化的过程，这个过程增加了细胞的活动性，并促进了侵袭性表型的发展。整个过程受到EMT转化因子的调控，主要包括锌指转录因子1（snail family zinc finger 1，snai1）、Twist相关蛋白（Twist related protein，TWIST）和锌指结合蛋白（Zinc-finger E-box binding homeobox，ZEB）家族。这些转化因子在癌症增殖、侵袭、转移等过程中均有重要作用。尽管目前对于EMT的认识存在一定的争议，但肯定的是，EMT在促进肿瘤转移、增殖、侵袭中具有重要作用[13]。

目前的研究证明，通过调节EMT相关mRNA的m6A甲基化修饰水平可以影响其生物学进程。在Hela细胞中，Lin X等人的研究表明[14]，EMT过程中m6A水平会升高，人为降低细胞m6A水平会抑制肿瘤细胞迁移、侵袭和EMT，进一步通过体外RIPPCR实验发现，甲基化识别酶YTHDF1可以特异性的识别EMT调控因子Snai1 mRNA蛋白质编码区m6A甲基化位点，并随着甲基化水平降低，减少真核翻译延伸因子2（eukaryotic translation elongation factor 2，eEF-2）与mRNA的结合，从而降低Snai1 mRNA的蛋白翻译延伸效率，间接影响肿瘤迁移、侵袭和EMT。Li J等人的研究得出了相似的结果，他们发现敲除METTL3可以增加转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）mRNA的表达量，延长mRNA半衰期，减短蛋白质半衰期，减少LTBPs（TGF-β前置物），抑制TGF-β激活，抑制TGF-β的自身诱导自身效应，最终抑制EMT过程[15]。而在肺癌中，敲除METTL3会降低EMT调控因子JUNB的mRNA表达、m6A甲基化修饰以及mRNA的半衰期，从而抑制肿瘤增殖、迁移、侵袭和EMT[16]。在卵巢癌中，敲除METTL3会降低EMT调控因子AXL受体酪氨酸激酶（AXL receptor tyrosine kinase，AXL）的甲基化水平并抑制其mRNA表达，并发现细胞质中的METTL3可以促进AXL的蛋白翻译效率，从而间接调控卵巢癌EMT[17]。在胃癌中，CDH1的表达降低与肿瘤的侵袭转移、恶性程度上升、预后不良相关[18]。最新的研究证明，METTL3在体外可以上调锌指MYM1型（zinc finger MYM-type 1，ZMYM1）mRNA的甲基化并通过阅读器RNA结合蛋白人类抗原R（human antigen R，HuR）增强mRNA稳定性，最终ZMYM1通过募集CtBP/LSD1/CoREST复合物抑制CDH1启动子的活性，从而促进胃癌的侵袭与转移[19]。

除了侵袭、转移、EMT，m6A甲基化同样影响肿瘤的糖酵解、血管形成及放化疗耐药性等多个生物学过程。Qiang W等人发现[20]，在胃癌中，m6A甲基化酶METTL3表达量较正常组织上升且提示不良预后，体外实验发现METTL3可以提升肝癌源性生长因子（hepatoma-derived growth factor，HDgF）mRNA的m6A甲基化水平，之后阅读器IGF2BP3同HDgF mRNA上的甲基化位点直接结合，增强mRNA稳定性，最终核内的HDgF通过激活葡萄糖转运蛋白4（insulin-responsive glucose transporter 4，GLUT4）和烯醇酶2（enolase 2，ENO2）来促进糖酵解；分泌的HDgF蛋白则促进肿瘤的血管生成。在放化疗药物抗药性的研究中，m6A甲基化的调控作用同样重要。目前已经证实m6A甲基化可以通过调控m6A甲基化位点变异、mRNA稳定性、mRNA翻译、ncRNA甲基化水平等方式影响肿瘤对放化疗抗药性[21]。

总的来说m6A甲基化对肿瘤各种表型的影响起始于甲基化酶和去甲基化酶动态调控关键RNA的甲基化水平。接着直接阅读器与m6A位点直接结合调控mRNA的降解、出核、翻译等过程；或者间接阅读器通过“m6A开关”机制影响目的RNA的生物学功能。最终与关键RNA相关生物学过程，如侵袭、转移、EMT、糖酵解、血管形成、放化疗抗药性等，均会受到影响。

三、m6A甲基化修饰在头颈鳞癌中的研究进展

头颈鳞癌是第六大常见肿瘤。随着免疫疗法、手术、放化疗等综合疗法的发展，头颈鳞癌的治疗较以前已有长足的发展，但头颈鳞癌的5年生存率仍不容乐观，因此，继续探究HNSCC肿瘤内在机制可能有助于临床治疗策略的制订以及相关药物的开发。表观遗传学研究表明，m6A甲基化在多种肿瘤生长过程中具有重要作用。目前，针对HNSCC的m6A甲基化研究较其他恶性肿瘤少，但仍可以看出m6A甲基化对HNSCC的调控作用。因此下文将对m6A甲基化调控HNSCC多种表型的内在机制做出讨论。

多篇生信研究显示，m6A相关基因与HNSCC肿瘤有着千丝万缕的联系。根据不同的研究方法及待选基因，得出的关键基因有所不同。Zhao X等人分析得出WTAP和METTL14可能是m6A RNA甲基化调节因子相互作用网络的中枢基因[22]。这与其他恶性肿瘤的研究相一致。另一篇研究则认为HNRNPC同样是关键基因之一[23]。这与Huang G Z等人的观点不谋而合，他们同样认可HNRNPC的重要性，并通过体外实验证实：HNRNPC的过表达会加速口腔鳞癌的EMT过程[24]。但遗憾的是，这篇文章并没有给出HNRNPC-EMT通路的具体交互机制，这是需要进一步探究的问题。以上结论暗示我们随着m6A甲基化的增多不利于HNSCC肿瘤的预后，但Zhang Y等人得出了相反的结论，他们发现FTO通过去甲基化钙粘蛋白相关蛋白1（cadherinassociated protein beta 1，CTNNB1）使得mRNA稳定性增强，间接调控HNSCC EMT，从而导致预后不良、肿瘤细胞增殖和迁移[25]。从结论上来看，一方观点认为甲基化过程会促进HNSCC的EMT，另一方则认为去甲基化会促进HNSCC的EMT，表面上看是矛盾的，但笔者推测：①由于部分m6A调控酶并非特异性的只与m6A甲基基团发生反应，存在调控酶与关键mRNA或蛋白直接发生作用的可能[26]，例如体外实验证明METTL3除了调控RNA甲基化，还可以在细胞质内直接结合mRNA调控蛋白质翻译过程[17]。或调控酶除了参与甲基化的调控，还有其他的生物学功能，例如FTO的发现是由于其参与了脂代谢。因此针对调节酶的研究存在许多“干扰结果”。②我们对m6A甲基化的了解并不全面，它是通过何种机制来调控mRNA的稳定、半衰期；如何影响蛋白质的翻译；相同甲基化酶对不同恶性肿瘤产生不同的作用结果是因为什么（在胃癌中，METTL3可以促进癌症[19]，在肝癌中，METTL3和METTL14则抑制癌症[29]）；在这个动态的过程中，甲基化和去甲基化好像博弈双方，此消彼长中究竟谁在主导，我们知之甚少。③目前对m6A的研究多集中于mRNA，而其他类型RNA同样存在m6A甲基化，已经有研究证明ncRNA同样通过m6A甲基化机制调控肿瘤的生长。

随着研究的深入，越来越多的m6A相关调控因子被发现，例如：mRNA结合蛋白IGF2BP2被发现其与多种生命活动相关，起初仅发现其对肿瘤的促进作用，但目前已经证明，IGF2BP家族的蛋白质是一种m6A阅读器，可以通过改变mRNA的稳定性而发挥调控肿瘤生长的作用[30]。在鼻咽癌中，IGF2BP2可以识别由METTL3调控的Snai1甲基化位点，并降低Snai1的蛋白质水平，最终促进肿瘤的EMT进程[31]。而在OSCC中，METTL3可以增加B淋巴瘤Mo-MLV插入蛋白1（BMI1 proto-oncogene，BMI1）mRNA 3＇-UTR的m6A修饰，并与IGF2BP1结合，促进OSCC中BMI1的翻译[32]。最近的研究表明，IGF2BP2可以识别EMT关键基因锌指转录因子2（snail family zinc finger 2，Slug）的m6A位点并改变Slug mRNA的稳定性，间接调控肿瘤的侵袭与转移[33]。这表明IGF2BP家族在HNSCC肿瘤的重要性[34]。

Li WC等人的研究显示，头颈鳞癌中己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）表达量较正常组织的大幅上升，导致肿瘤细胞糖酵解、侵袭、转移等生物学进程的活跃，并发现HK2的下调可以降低HNSCC对化疗药物的耐药性[35]。另一个糖酵解关键酶乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）在HNSCC中同样上调[36]。同时，已有体内体外实验证明，METTL3可以识别HK2 mRNA 5＇/3＇UTR区甲基化位点，并通过IGF2BP2或IGF2BP3提高RNA稳定性，从而调控肿瘤的糖酵解[37]。虽然目前没有针对m6A甲基化与HNSCC糖酵解之间关系的研究，但可以预见，m6A甲基化很有可能通过调控糖酵解关键酶影响HNSCC代谢、糖酵解、化疗药物耐药性等过程。

除了mRNA，环状RNA（circRNA）通过竞争性内源RNA（ceRNA）机制同样影响肿瘤的生长，例如circRNA CDR1as通过ceRNA机制负调控miR-7-5p来促进鼻咽癌细胞的生长和糖代谢[38]。而我们对circRNA m6A修饰的研究刚刚起步。有研究发现circCUX1在对放射治疗不敏感的HPSCC患者中上调，而进一步试验证明，METTL3介导circCUX1的m6A甲基化从而延长circCUX1的半衰期，接着circCUX1与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase1）结合并抑制其表达，导致炎症因子释放减少，从而产生了放射治疗抗性[39]。

随着对m6A甲基化研究的深入，其在HNSCC中的关注度逐渐上升。进一步探索这种表观遗传调控肿瘤模型有助于开发新的HNSCC诊断/治疗靶点，而这也是目前临床上面对HNSCC的难点。证据表明，m6A甲基化与HNSCC的多个生物学进程有关，但这些结果间是否具有相关性目前尚不清楚，但可以肯定的是，m6A-EMT通路是HNSCC发展、侵袭和转移的一个重要机制，针对此处的进一步研究是十分必要的。除此之外，目前研究多集中于编码蛋白的mRNA，而ncRNA鲜有涉及，但先前的研究证明ncRNA介导的表观遗传修饰通过多种信号通路在HNSCC中发挥重要作用，因此全面了解m6A甲基化不应局限于已知的m6A相关酶。