α-鹅膏毒肽诱导肝细胞毒性作用机制的研究进展

许 悦，王 婵，林纾丞，张慧洁，澹 忆，张树威，曾晓锋，李 桢

（昆明医科大学法医学院，云南 昆明 650500）

在全球范围内，每年野生菌中毒造成约数百人死亡，数千人需要医疗救助，国内频发野生菌中毒事件，其中90%以上中毒死亡事件由鹅膏毒肽类野生菌引起[1]。云南省作为我国的野生菌大省，占有全国三分之二的野生菌资源，野生菌中毒在云南省食源性疾病、食物中毒发生和死亡中占主要原因[2]。鹅膏毒肽从胃肠道吸收，经门静脉运至肝脏，肝细胞毒性主要归因于α-鹅膏毒肽在肝脏中通过肠肝循环积累，临床症状主要表现为急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）。鹅膏毒肽类野生菌中毒包括4 个阶段：（1）潜伏期：潜伏期长是肝损害型中毒主要特征之一；（2）胃肠期：以恶心、呕吐、腹泻、腹痛和血尿为特征；（3）假愈期：症状消失，出现看似好转的现象，此阶段α-鹅膏毒肽与核内RNA 聚合酶Ⅱ结合并破坏蛋白合成；（4）内脏损害期：出血、抽搐和暴发性肝衰竭发生，导致昏迷和死亡[3-5]。鹅膏毒肽类野生菌中毒引起的高发病率和死亡率已成为重要的全球公共卫生健康问题，文章主要从α-鹅膏毒肽中毒机制和治疗相关方面进行综述。

1 α-鹅膏毒肽

α-鹅膏毒肽是一种强大的天然肝毒素，属于从致命鹅膏菌中分离出的双环八肽，由至少9种不同化合物组成。它的双环八肽结构包含2 个氧化氨基酸即：反式4-羟基脯氨酸（hydroxy proline，Hyp）和（2S、3R、4R）-4、5-二羟基异亮氨酸（dihydroxyisoleucine，DHIle），这是其毒性的关键[6-7]。α-鹅膏毒肽的毒性还与其化学结构密切相关，有无S=O 键、环肽结构及整体空间结构变化都会影响其毒性，作为一种耐热因子，其具有热稳定性，不会因煮沸、烹饪、干燥、蒸或冷冻而失去生物学活性[8]。目前研究表明，α-鹅膏毒肽的主要靶器官是肝脏，它经胃肠道吸收至门静脉循环入肝后发挥其毒性作用。RNA pol Ⅱ被抑制后肝细胞的蛋白质合成再生能力被破坏，随后发生小静脉中心和门静脉周围出血性肝坏死，肝损伤生物标志酶-血清转氨酶迅速增加，导致肝脏的不可逆损伤[9]。依据氨基酸组成及其结构的不同，将鹅膏肽类毒素分为鹅膏毒肽（Amatoxins）、鬼笔毒环肽（Phallotoxins）和毒伞素（Virotoxin），这3 类都是环化小分子。毒伞素无对人有害的证据，鬼笔毒环肽为速发毒性，而鹅膏毒肽为迟发毒性[10]。鹅膏毒肽又称毒伞肽，根据侧链取代基团的不同分为α-鹅膏毒肽（αamanitin）、β-鹅膏毒肽（β-amanitin）、γ-鹅膏毒肽（γ-amanitin）等。近年来，鹅膏毒肽相关研究主要集中在α-鹅膏毒肽，主要从灰花纹鹅膏、淡红鹅膏、致命鹅膏、假淡红鹅膏等有毒鹅膏菌中检出[11]。在有毒鹅膏菌中，平均毒素浓度从菌盖到菌柄再到菌托呈下降趋势，不同鹅膏毒肽的平均毒素浓度从α-amanitin ＞ phallacidin ＞ βamanitin ＞ γ-amanitin 依次下降[12]。α-鹅膏毒肽是原代毒素，含有α-鹅膏毒肽的鹅膏菌是导致大多数野生菌中毒的主要原因，通过与RNA 聚合酶II 不可逆地结合而损害肝脏，在肠腔内被快速吸收，通过牛磺胆汁酸钠共转运多肽（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）途径被转运到至肝细胞膜上通过有机阴离子转运多肽（organic anion transport polypeptides，OATP）进入肝脏，之后借助于肠肝循环造成α-鹅膏毒肽对肝脏的直接毒性作用，产生广泛的中心叶坏死并导致急性肝衰竭。

2 α-鹅膏毒肽抑制肝细胞RNA 聚合酶Ⅱ活性

RNA 聚合酶II 是转录真核蛋白编码基因以产生mRNA 的中心酶，α-鹅膏毒肽是公认的RNA聚合酶II 特异性抑制剂。α-鹅膏毒肽与RNA 聚合酶II 的最大亚基Rpb1 高亲和力结合并抑制RNA 链延伸步骤的转录，它含有的非典型氨基酸残基二羟基异亮氨酸[Ile（OH）2]、羟基脯氨酸（Hyp）和羟基色氨酸[Trp（OH）]，是其发挥毒性作用及对RNA 聚合酶II 高亲和力的关键[7]。抑制转录是由于α-鹅膏毒肽直接干扰触发环（trigger loop，TL）1 085 位置的组氨酸残基[13]，触发环是一种可移动的元件，通过折叠以催化RNA 链的延伸，对于催化后核酸易位到下一个DNA 模板位置至关重要，蛋白质合成依赖的肝脏再生能力被破坏，引起肝细胞的坏死改变[7]。药代动力学表明α-鹅膏毒肽随胆汁酸的肠肝循环到达肝脏直接与RNA 聚合酶II 不可逆结合，作用肝细胞核，并抑制其干扰DNA 和RNA 易位的活性导致肝细胞死亡[14]。α-鹅膏毒肽诱导OATPs 转运体损伤，OATPs 属于有机阴离子脂溶性载体多肽超家族，能介导药物及内源性物质的转运，其中OATP1B1 和OATP1B3 在肝脏中高表达，位于肝细胞的基底侧，在肝脏的药物摄取过程中起到很重要的作用[15]。在血液中的鹅膏毒肽通过肝窦细胞膜上的有机阴离子转运多肽OATP1B3 及肝细胞膜上48 000 和53 000 的2 个载体蛋白系统进入肝细胞[10,16]。由于其对RNA 聚合酶II 的高选择性抑制，α-鹅膏毒肽进入细胞后可抑制肝细胞的增殖和附着，这与其强毒性直接相关[17]。因此，随着mRNA 水平的降低，蛋白质合成减少，高周转率的细胞，如肝细胞、GIS 上皮细胞和肝小管细胞的蛋白质合成受阻，最终导致肝细胞死亡[18]。近来，研究发现利用α-鹅膏毒肽结构抑制剂来避免RNA 聚合酶Ⅱ失活，也不能缓解存活动物的晚期死亡情况，也就表明α-鹅膏毒肽对RNA 聚合酶Ⅱ的占位性抑制并不是其损伤肝细胞的唯一路径[19]。

3 α-鹅膏毒肽诱导肝细胞凋亡和自噬

细胞凋亡是细胞死亡的一种基因控制机制，对正常发育过程中消除不需要的细胞和维持组织稳态至关重要，α-鹅膏毒肽可通过诱导细胞凋亡导致肝细胞损伤，且α-鹅膏毒肽诱导肝细胞凋亡主要通过线粒体凋亡途径发生[20]。Arima 等[21]研究表明，α-鹅膏毒肽抑制RNA 聚合酶Ⅱ介导的mRNA 转录可诱导P53 依赖的细胞凋亡，引起促凋亡基因Bax 和抗凋亡基因Bcl-2 的表达改变，从而激活了半胱氨酸蛋白酶级联途径，RNA 聚合酶Ⅱ被抑制所引起的转录受阻和蛋白降解导致抑癌基因P21Cip1 下调，P53 积累增多并易位至线粒体促进细胞色素C 的释放，促使细胞进入S 期，随后发生凋亡。α-鹅膏毒肽能诱导小鼠肝细胞发生凋亡，并在一定剂量范围内有剂量依赖性和时间依赖性效应，肝细胞凋亡率随剂量的增大和作用时间延长而增加[22]。Jan Magdalan 等[23]在犬类肝细胞中进行实验研究证明，α-鹅膏毒肽引起的细胞毒性不仅会导致肝细胞死亡，还可导致肝细胞发生凋亡，且肝细胞的存活能力与α-鹅膏毒肽的浓度、α-鹅膏毒肽暴露时间之间有明显的相关性。研究表明，α-鹅膏毒肽可与内源性细胞因子协同作用，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-α），产生细胞损伤并诱导细胞凋亡[5]，细胞凋亡参与α-鹅膏毒肽肝细胞损伤发病过程，尤其在中毒早期阶段。肝细胞染色质组织的紊乱是细胞核中的α-鹅膏毒肽引起的第一个变化，还可出现核仁分散，形成的颗粒团簇分散在整个核内[24]。与凋亡不同，自噬是一个主动的细胞保护过程，它是吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，借此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新[25]。Chen X 等[26]研究表明，α-鹅膏毒肽可诱导L-02 细胞发生自噬，主要表现在LC3-II 蛋白水平的增加和p62 蛋白水平的逐渐降低上，增加给药剂量后，LC3-II 蛋白水平先增后降，p62 蛋白水平先降后增。α-鹅膏毒肽给药后小鼠体内的海藻糖表达显著降低以及L-02 细胞中LC3-II和p62 蛋白水平的波动均表明自噬参与L-02 细胞损伤过程，上述实验结果提示自噬参与了α-鹅膏毒肽中毒后肝细胞受损线粒体的清除过程[26]。Gu X 等[27]研究表明，自噬对α-amanitin 诱导Hepa1-6 肝癌细胞凋亡有促进作用，且该过程与ROS 无关。自噬对细胞有着双向调节作用，适度自噬对细胞起着保护作用，过度自噬可造成细胞自噬性死亡，LC3-II 和p62 蛋白随着α-鹅膏毒肽给药剂量增加呈现波动性变化使得我们开始思考自噬在随着给药剂量增加的同时是否还具备主动保护和维持细胞稳态的作用。

4 α-鹅膏毒肽诱导肝细胞炎症

肝脏作为最大的消化腺，易受到各种由代谢物、毒性物质、微生物等引起的损伤，导致肝细胞死亡并诱导炎性细胞募集，诱发炎症反应[28]。曹玫等[29]在小鼠动物模型中尾静脉注射LD50（0.327 mg/kg）剂量α-鹅膏毒肽后病理学组织发现小鼠肝细胞脂肪变性，肝脏充血、溶血，肝细胞呈气球样变，肝小叶内有炎性细胞浸润，肝脏局灶性坏死；病变严重者可见大量炎细胞浸润，形成细胞结节，坏死面积增大。研究发现，α-鹅膏毒肽可诱导肝细胞显著炎症反应，在小鼠体内实验中肝脏免疫组化切片显示NF-κB 易位细胞核；与空白组相比，α-鹅膏毒肽组激活核NF-κB 阳性表达显著增加；在体外实验α-鹅膏毒肽致L-02 细胞毒性模型中检测NF-κB、p-NFκB、IκB-α、p-IκBα 蛋白表达，IκBα 及其磷酸化状态对于NF-κB 的激活或抑制以及经典信号通路的传导至关重要，p-NFκB 水平随着时间的推移而显著增加，α-鹅膏毒肽也诱导了L-02 细胞中IκB-α 的磷酸化[26]。

5 α-鹅膏毒肽诱导肝细胞氧化应激

氧化应激被定义为活性氧（reactive oxygen species，ROS）与抗氧化之间能力平衡的损害，它是大多数中毒类型中常见的病理生理途径。Antoaneta Z 等[30]研究发现ROS 负荷增加和氧化应激参与了α-鹅膏毒肽引起的肝细胞毒性过程，并提出了自由基反应导致严重的α-鹅膏毒肽肝毒性的假设，随后证实自由基中间体及ROS 的产生增多加重α-鹅膏毒肽导致的肝细胞毒性。Zerrin D 等[31]研究证明，氧化应激是α-鹅膏毒肽诱导肝毒性的原因，在这项实验研究中，通过评估三种不同水平的小鼠α-鹅膏毒肽模型中氧化应激标记（SOD、CAT、GPx、MDA、TOS 和TAS）的趋势，证实氧化应激在α-鹅膏毒肽毒性作用中占有重要地位，对多器官显示出毒性作用，尤其是肝脏和肾脏。研究表明，α-鹅膏毒肽相关损伤与活性氧种类之间存在关系，α-鹅膏毒肽可以增多自由基中间体的转化，增加活性氧的产生，如过氧化氢、超氧化物和羟基的产生，这是导致肝细胞膜损伤的主要原因[32-33]。Chen X等[20]研究结果表明，α-鹅膏毒肽诱导的细胞凋亡主要通过线粒体凋亡途径发生，并与氧化损伤有关，L-02 细胞总反应氧和线粒体反应氧（ROS）水平随时间的增加而增加，ROS 是一种参与α-鹅膏毒肽诱导小鼠肝细胞和L-02 细胞凋亡的上游信号分子。

6 药物对α-鹅膏毒肽诱导肝细胞毒性的干预作用

6.1 N-乙酰半胱氨酸

N-乙酰半胱氨酸是一种具有自由基清除作用的半胱氨酸的乙酰基衍生物，是人体内还原型谷胱甘肽的前体物质，其主要经肝脏和肠道代谢，同时还能预防DNA 损伤、调节细胞的代谢活性、调整基因的表达和信号转导，抗血管生成、抗细胞凋亡等作用[34]。N-乙酰半胱氨酸是一种公认的谷胱甘肽前体，对肝细胞具有保护作用，在α-鹅膏毒肽诱导肝细胞毒性中，N-乙酰半胱氨酸可清除自由基，具体效果依赖于肝脏谷胱甘肽的复制，起到抗炎、抗氧化作用[35]。维生素C、维生素E、西咪替丁、硫代酸等药物具有直接和间接的抗氧化作用，但不具有特定的组织取向性，因而很少用于α-鹅膏毒肽的中毒治疗[36]。

6.2 水飞蓟宾

水飞蓟，又称奶蓟，是一种优良的护肝植物，一种黄铜木质素类混合物，水飞蓟宾是奶蓟种子中主要活性成分[37]。水飞蓟宾具有清除自由基、维持细胞膜稳定性、抗脂质过氧化、降血脂等药理活性，它可以促进肝细胞再生，改善肝功能，具有较强的肝脏保护作用，临床上常用来治疗肝纤维化、非酒精性脂肪肝、酒精性肝病等肝损伤疾病[38]。α-鹅膏毒肽中毒最有效的临床解毒剂是水飞蓟宾，它可以抑制位于肝细胞膜上OATP1B3 和NTCP 对α-鹅膏毒肽的摄取，同时在氧化应激条件下具有清除自由基和抑制脂质过氧化、稳定膜结构和保护酶等抗氧化作用[10]。水飞蓟宾对α-鹅膏毒肽所致的受损肝细胞起到保护和促进细胞增殖的作用，作为一种具有肝保护特性的解毒剂，水飞蓟宾减低了自由基的产生，抑制肿瘤坏死因子（TNF-α）的释放，刺激受损肝细胞的蛋白质合成[39]。

6.3 多粘菌素B

多粘菌素B 作为窄谱抗菌药物，从多粘类芽孢杆菌中分离而来，对大多数革兰氏阴性菌均有较好的抗菌活性[40]。α-鹅膏毒肽的主要毒性机制（即抑制RNA polⅡ活性），理想的治疗方法是取代α-鹅膏毒肽与RNA polⅡ结合而不影响其正常转录活性的竞争，多粘菌素B 被证明可以在α-鹅膏毒肽同一位点与RNA polⅡ结合，阻止毒素与RNA polⅡ结合，多粘菌素B 不仅对基因表达有强烈的影响，而且对α-鹅膏毒肽诱导肝细胞损伤有明显的保护[41]。Juliana G 等[36]研究发现，在小鼠体内多粘菌素B 有效地恢复了肾脏中α-鹅膏毒肽诱导的mRNA 转录抑制；组织学和肝转氨酶血浆数据均提示多粘菌素B 显著降低肝和肾中α-鹅膏毒肽诱导的细胞损伤；生存实验研究发现所有暴露于α-鹅膏毒肽的动物在5 d 内死亡，而在服用α-鹅膏毒肽4、8 和12 h 后给予多粘菌素B，动物50%存活到30 d。

6.4 青霉素G

青霉素G 是一种常用抗生素，主要作用于革兰氏阳性菌，常为抗菌药物的首选。α-鹅膏毒肽的流入是由OATP 的一种亚型介导的，其中OATP1B1 和OATP1B3 是摄取的关键转运体，青霉素G 因其可抑制OATP1B3 摄取转运体向肝细胞内转运α-鹅膏毒肽而起到肝脏保护作用而被广泛应用于鹅膏毒肽中毒治疗[16]。

6.5 白藜芦醇

白藜芦醇是一种含有多酚结构化合物，它主要存在于红葡萄，花生、松树、豆类等植物中，是一种生物活性很强的多酚类物质，常被用于药物和毒素引起肝毒性相关研究[42]。近年研究表明，白藜芦醇可以保护肝脏，对抗胆汁淤积、药物和酒精诱导的损伤，白藜芦醇因其具有抗氧化、抗炎作用而被用于α-鹅膏毒肽的中毒治疗中[43]。

α-鹅膏毒肽是大多数致命鹅膏菌发挥毒性作用的关键，中毒后没有普遍接受的解毒剂或标准化治疗方法，治疗通常包括重症支持性护理，液体和电解质不平衡、凝血障碍和低血糖等[44]。α-鹅膏毒肽严重中毒可导致急性肝功能衰竭，中毒治疗常使用治疗急性肝衰竭的标准治疗方法。由于缺乏特异性解毒剂，早期的胃肠道毒物清除及胃肠炎期治疗及诊断就显得尤为重要。临床使用N-乙酰半胱氨酸、水飞蓟宾、青霉素G 进行抗氧化治疗及抑制OATP1B3 对α-鹅膏毒肽的摄取来减轻肝细胞毒性损伤。发展至肝衰竭期需进行保肝、血浆置换、排毒和清除代谢产物、预防肝性脑病等治疗，肝移植也就成为α-鹅膏毒肽中毒后肝衰竭的最有效解救方法。

7 小结

野生菌中毒是影响公众健康最突出的公共卫生问题之一，鹅膏毒肽中毒会引起以急性肝衰竭为主要特征的一种疾病，病程进展快，病死率高。目前，α-鹅膏毒肽中毒第一阶段的非特异性症状使得中毒的诊断及治疗变得不同，很大程度限制了治疗措施的有效性，对于α-鹅膏毒肽致肝细胞毒性的机制缺乏基础研究，仍待进一步明确。近年来，α-鹅膏毒肽相关研究更多集中在代谢组学，毒理学机制方面的研究仍待进一步完善，如α-鹅膏毒肽诱导肝细胞氧化应激、凋亡、炎性反应、自噬的作用途径尚未完全阐明，这也就意味着需要更多的实验数据支撑，在一定程度上为笔者提供了研究方向。文章对α-鹅膏毒肽诱导肝细胞毒性作用机制及相关治疗药物进行了综述，α-鹅膏毒肽通过诱导肝细胞发生氧化应激、凋亡、炎性反应及自噬等在肝细胞毒性中起到一定的作用，通过抑制RNA 聚合酶II 造成蛋白合成受阻，从而细胞坏死，加重损伤引起急性肝衰竭。中毒后治疗主要包括使用N-乙酰半胱氨酸、水飞蓟宾、青霉素G、多粘菌素B、白藜芦醇、血浆置换及肝移植等进行相关抗炎、抗氧化、保肝等治疗。文章通过对α-鹅膏毒肽肝细胞毒性作用机制及相关治疗药物作用机制的总结，为后续α-鹅膏毒肽相关治疗药物研发提供一定的理论依据。