外源水杨酸对盐胁迫下大黄种子萌发及幼苗生长的影响

梁小燕，李依民,3，高 静,3，徐 进，颜永刚，张 岗,3*

(1 陕西中医药大学 药学院/陕西省秦岭中草药应用开发工程技术研究中心，西安 712046；2 陕西中医药大学省部共建特色秦药资源研究开发国家重点实验室[培育]，陕西咸阳 712083；3 陕西中医药大学陕西省中医药管理局“秦药”研发重点实验室，西安 712046；4 镇巴县百花谷现代农牧开发有限公司，陕西汉中 723600)

种子萌发是植物生命周期中一个脆弱而重要的时期，直接关系到幼苗的形态发生和生长[1]。环境胁迫如高盐、干旱、水涝或缺氧等非生物胁迫抑制种子萌发，限制作物生产[2]。高盐是最为常见的一种胁迫，其通过降低土壤水势抑制种子萌发，从而削弱种子吸收水分的能力以抑制种子吸胀和胚的生长[3]。但是，盐胁迫抑制种子萌发的内在机制极其复杂。

水杨酸(salicylic acid，SA)是一种重要的植物激素，可以通过复杂的信号转导网络参与植物对逆境的响应过程[4]。SA通过提高叶片渗透调节物质含量和抗氧化酶活性，降低细胞膜脂过氧化作用来有效提高植物的抗盐性[5]。外源施用一定浓度的水杨酸可提高多种植物的耐盐性，常包括拌种和浸种两种方式[6-7]。0.08 mmol/L SA拌种显著提高二色补血草种子在200 mmol/L NaCl条件下的萌发率以及部分酶活性和内源激素含量[6]。0.1、0.2与0.4 mmol/L SA浸种使盐胁迫下的水飞蓟种子具有较高萌发指数和幼苗生长指标[7]。SA浸种能促进重度 NaCl 胁迫下膜荚黄芪和蒙古黄芪种子的最终发芽率[8]。

中国传统大宗中药材大黄在2020年版《中国药典》中规定为蓼科大黄属(Rheum)多年生高大草本掌叶大黄(RheumpalmatumL.)、唐古特大黄(R.tanguticumMaxim. ex Balf.)或药用大黄(R.officinaleBaill.)的干燥根及根茎，味苦、性寒，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒等功效，用于实热积滞、血热吐衄、目赤咽肿等症[9]。大黄主要含有蒽醌类、蒽酮类、黄酮类、鞣质类等多种有效成分[10]，具有泻下、抗炎和止血等药理活性[11]。大黄主要分布在亚温带及亚热带的高寒山区，其道地产区为中国甘肃、青海、四川、陕西等高海拔地区[11]。大黄喜光照、耐严寒，不适宜在温度较高或潮湿的地方生长，且野生资源有限，现多为栽培品[12]。气候环境的不断恶化以及人类活动的影响使土壤盐渍化程度在全球范围内不断加剧，严重影响植物的形态建成与生态分布[13]，势必影响大黄的栽培和生长。目前，大黄研究主要集中在化学成分、药理作用、种质资源及次生代谢调控等方面[14]，而对其耐盐特性研究报道较少。因此，本研究考察了SA拌种和浸种两种方式对盐胁迫下3种大黄种子萌发及幼苗生长发育的影响，旨在为大黄在盐胁迫下的栽培提供一定理论支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

实验所用3种大黄种子由陕西中医药大学药学院王继涛高级实验师鉴定为掌叶大黄(R.palmatumL.)、唐古特大黄(R.tanguticumMaxim.ex Balf.)和药用大黄(R.officinaleBaill.)的干燥成熟种子，分别产自甘肃省和政县(2019年8月)、甘肃省湟中县(2019年9月)、陕西省镇巴县(2020年8月)。SA购自上海源叶生物公司，NaCl为国产分析纯。

1.2 试验处理

选择大小均匀、饱满的3种大黄种子，分别置于蒸馏水中浸泡24 h后，按照黑小斌等[15]建立的方法进行大黄种子消毒处理，用无菌蒸馏水冲洗3～4次后待用。

试验使用NaCl模拟盐胁迫。将NaCl配制成0(CK)、100、150、200、250 mmol/L 5个浓度梯度溶液进行盐胁迫下3种大黄种子的萌发实验。发现掌叶大黄、唐古特大黄种子萌发均在250 mmol/L NaCl下受到明显抑制，药用大黄种子萌发在150 mmol/L NaCl胁迫下受到显著抑制，所以掌叶大黄、唐古特大黄选择200 mmol/L NaCl浓度药用大黄选用100 mmol/L NaCl浓度配合外源水杨酸进行拌种和浸种实验。

通过预试验以及查阅文献后将SA处理浓度设定为50、100、150、200和250 mg/L。SA施用方式为拌种和浸种两种[8]。拌种的具体方法是：将SA与NaCl配制成符合试验设计浓度的溶液，加入种子发芽床，使SA始终贯穿整个处理过程。浸种的具体方法是：将大黄种子浸泡于SA溶液24 h后，用蒸馏水冲洗至净后置入发芽床，此后种子不再与SA接触。试验在垫有3层滤纸的150 mm培养皿中进行，每个培养皿中100粒种子，重复3次。所有材料在(20±2)℃、12 /12 h光照/黑暗、光照强度15 000 Lx的培养箱中培养，每天加入适量相应浓度溶液以保持滤纸湿润。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 种子萌发指标每天记录种子的发芽个数，连续观察10 d。第5 天计算种子发芽势；第10 天计算种子发芽率和相对NaCl伤害率。

累积发芽率(%)=10 d内萌发种子数/供试种子总数×100%；

发芽势(%)=5 d内萌发种子数/供试种子数×100%；

1.3.2 幼苗生长指标实验进行至第10 天时，从每处理组各重复组中任意取10株幼苗测量其子叶、胚轴、根及苗长。

1.4 数据处理

使用Excel 2019 对数据进行绘图分析，SPSS 24.0 数据统计软件对相关种子萌发和生长指标进行处理和差异显著性检验(LSD法)。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对大黄种子萌发和幼苗生长的影响

首先，随着NaCl浓度的增大，3种大黄种子的每日累计发芽率和发芽势(5 d的累计发芽率)整体均呈下降趋势(图1)。其中，掌叶大黄种子每日累计发芽率和发芽势在100 mmol/L NaCl浓度下与对照(CK)无显著差异(P> 0.05)，在NaCl浓度大于等于150 mmol/L时均比CK显著下降(P<0.05)；唐古特大黄种子每日累积发芽率在100 mmol/L NaCl浓度下与CK相差无几，在NaCl浓度大于等于150 mmol/L时比CK显著下降，其发芽势在NaCl浓度大于等于150 mmol/L时显著下降；药用大黄种子每日累积发芽率和发芽势均在NaCl浓度大于等于100 mmol/L时比CK显著下降，在250 mmol/L NaCl胁迫条件下发芽率极低。可见，3种大黄种子发芽率均随NaCl浓度增大显著下降。

图1 不同浓度NaCl胁迫下大黄种子累积发芽率的变化Fig.1 The cumulative germination rate of rhubarb seeds under different NaCl concentrations

其次，随着NaCl胁迫浓度的增加，3种大黄幼苗的子叶、胚轴、根系和苗的长度均逐渐降低，幼苗生长均受到严重抑制，且几乎所有指标降低幅度均在 100 mmol/L NaCl 胁迫时就达到显著水平(图2)。其中，掌叶大黄和药用大黄幼苗的子叶长在100 mmol/L NaCl胁迫时就比相应CK显著降低(P<0.05)，而唐古特大黄幼苗的子叶在150 mmol/L NaCl胁迫时才受到显著抑制(图2，A)；掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄幼苗的胚轴长、根长和苗长均在100 mmol/L NaCl胁迫时就比相应CK显著降低(图2，B～D)。以上结果说明3种大黄幼苗的生长大多在100 mmol/L NaCl胁迫下受到显著抑制。

与CK相比，掌叶大黄幼苗的子叶长、胚轴长、根长和苗长受到的抑制作用大体上随盐浓度的增大而递增(P<0.05)，且胚轴、根和苗在NaCl浓度大于等于 100 mmol/L 时受到显著抑制。唐古特大黄幼苗的子叶在NaCl大于100 mmol/L 时受到显著抑制，其根和苗在NaCl大于等于100 mmol/L 时受到显著抑制。随着NaCl浓度的增大，药用大黄幼苗的子叶、胚轴、根及苗受到的抑制作用整体呈递增状态。

同一物种内不同小写字母表示处理间差异达5%水平图2 不同浓度NaCl胁迫下大黄幼苗子叶(A)、胚轴(B)、根(C)和苗(D)生长的变化Different lower-case letters within same species indicate statistically significant difference among treatments at 0.05 level (P<0.05)Fig.2 The growth of cotyledons (A), hypocotyl (B), roots (C) and seedlings (D) of rhubarb seedlings under different NaCl concentrations

2.2 水杨酸拌种对NaCl胁迫下大黄种子萌发及幼苗生长发育的影响

2.2.1 种子萌发指标表1显示，在S200或S100处理下，掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄种子的发芽率和发芽势均显著低于空白对照(CK)，且发芽势的降幅(61.74%～88.65%)远大于发芽率降幅(21.23%～29.62%)。与S200处理相比，掌叶大黄种子发芽率在50 mg/L SA拌种处理下显著提高(P<0.05)，在200和250 mg/L SA处理后显著降低，而其发芽势仍仅在50 mg/L SA处理显著增加，在250 mg/L SA处理后显著降低。与S200处理相比，唐古特大黄种子发芽率仅在250 mg/L SA处理时显著降低，其发芽势在各浓度SA拌种处理后均无显著变化。与S100处理相比，药用大黄种子发芽率仅在150和250 mg/L SA拌种处理后显著降低，而其发芽势仅在200 mg/L SA拌种后显著降低，而其他浓度SA处理后发芽率和发芽势均无显著变化。可见，盐胁迫下掌叶大黄种子发芽率和发芽势在50 mg/L SA拌种后均能得到显著促进，而在250 mg/L SA拌种后均受到显著抑制；而盐胁迫下唐古特大黄和药用大黄种子发芽率和发芽势在各浓度SA拌种后均无显著促进效应，其发芽率在250 mg/L SA拌种处理后均受到显著抑制。

2.2.2 幼苗生长指标从表1可知，掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄种子的生长指标子叶长、胚轴长、根长和苗长在S200或S100处理下均显著低于相应CK(P<0.05)，它们的子叶长在各浓度SA拌种处理下均与S200或S100处理无显著差异(P> 0.05)。与S200处理相比，掌叶大黄胚轴长仅在50和250 mg/L SA拌种处理后显著降低，根长在50、150和200 mg/L SA处理后显著增加，苗长仅在200 mg/L SA处理下显著增加，其余浓度SA拌种处理后胚轴长、根长、苗长均无显著变化；与S200处理相比，唐古特大黄胚轴长、根长、苗长在50～200 mg/L SA处理后均无显著差异，而均在250 mg/L SA处理后显著降低；与S100处理相比，药用大黄胚轴长仅在50 mg/L SA处理后显著增加，苗长仅在200和250 mg/L SA拌种处理后显著降低，其余浓度SA处理胚轴长和苗长均无显著变化，而其根长在各浓度SA处理下均与S100处理无显著差异。

2.3 水杨酸浸种对NaCl胁迫下大黄种子萌发及幼苗生长发育的影响

2.3.1 种子萌发指标掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄种子的发芽率和发芽势在S200或者S100处理下均比相应CK显著降低，且发芽势降低的幅度远大于发芽率。与S200处理相比，掌叶大黄的发芽率在50和200 mg/L SA浸种处理下，在其余浓度SA浸种处理后无显著变化，而其发芽势在各浓度SA浸种处理后均显著增加(表2)；与S200处理相比，唐古特大黄种子发芽率各浓度SA浸种处理后均无显著差异(P> 0.05)，发芽势在50～200 mg/L SA浸种均得到显著促进(P<0.05)；与S100处理相比，药用大黄发芽率和发芽势在50～250 mg/L SA浸种处理后与对照均无显著变化。可见，适宜浓度的SA浸种对200 mmol/L NaCl盐胁迫下的掌叶大黄发芽率以及掌叶大黄、唐古特大黄的发芽势有显著的促进效应，但种间存在差异。

2.3.2 幼苗生长指标表2显示，掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄的子叶长、胚轴长、根长和苗长在S200或S100处理下也均显著低于相应CK(P<0.05)。与S200或S100处理相比，3种大黄的子叶长在各浓度SA浸种处理下均无显著变化(P> 0.05)，三者的胚轴长除掌叶大黄在150 mg/L SA浸种处理后显著降低外也均无显著变化；掌叶大黄根长和苗长均在50、200和250 mg/L SA浸种处理下比S200处理显著增加，唐古特大黄和药用大黄根长和苗长均在50 mg/L SA浸种处理下比S200或S100处理显著增加，其余浓度下大黄根长和苗长与S200或S100相比无显著差异。可见，盐胁迫下各种大黄的子叶长和胚轴长受SA浸种的影响较小，而其根长和苗长生长在适宜浓度的SA浸种受到显著促进，尤其是50 mg/L SA浸种对各大黄普遍表现出显著促进效应。

表2 SA浸种对 NaCl胁迫下大黄种子萌发及幼苗生长的影响

3 讨 论

盐胁迫是影响植物种子萌发的重要环境因子[16]。生长特性是植物对盐胁迫的综合反应，也是植物抗盐性的最优评价指标[17]。大量研究表明，盐胁迫显著抑制了植物种子的萌发[18]、萌芽幼苗的大小和胚根的长度[19]。本研究结果表明，随着盐浓度的增大，3种大黄种子的发芽率、发芽势整体呈下降趋势，且它们所受盐相对伤害率随盐浓度增大依次递增，并以药用大黄的相对伤害率变化速率最大；同时，盐胁迫也显著抑制了3种大黄幼苗的子叶、胚轴、根和苗的生长，此结果与黄芪[8]、百日草[20]和甘草[21]等的相关研究结果一致。

本研究结果表明，50、100、150 mg/L SA浸种均促进了盐胁迫下掌叶大黄种子发芽势，但仅有50 mg/L SA浸种处理最终提高了掌叶大黄种子发芽率；200 mg/L SA浸种促进盐胁迫下唐古特大黄种子的发芽势，而250 mg/L SA拌种却抑制了盐胁迫下唐古特大黄种子的发芽率；200 mg/L SA拌种抑制了盐胁迫下药用大黄种子发芽势，而150 mg/L SA拌种抑制了其盐胁迫下的发芽率。水杨酸浸种促进掌叶大黄、唐古特大黄种子发芽，有可能是浸种能使种子在获取SA的同时通过吸胀作用获得水分来支持胁迫下种子的萌发，而拌种处理使种子一直都存在于SA溶液中，SA胁迫产生的抑制作用远大于其补偿作用[8]。

同时，200 mg/L水杨酸拌种也促进了掌叶大黄苗长，这与60 mg/L水杨酸喷施处理促进NaCl胁迫下喜树幼苗生长[22]类似；250 mg/L SA浸种促进了掌叶大黄幼苗在盐胁迫下根和苗的生长。50 mg/L SA浸种促进盐胁迫下唐古特幼苗根和苗的生长，其余浓度下根长和苗长与单独盐胁迫相比无显著差异，说明唐古特幼苗对SA的响应存在浓度效应。50 mg/L SA拌种促进了盐胁迫下药用大黄胚轴生长，而250 mg/L SA拌种抑制了盐胁迫下药用大黄的苗长，100 mg/L SA浸种均促进盐胁迫下药用大黄根和苗的生长，而100 mg/L SA加重了盐胁迫下凤仙花种子的伤害[23],这可能与SA的施用方式以及不同植物对SA的响应差异有关。

本研究结果表明，药用大黄种子及幼苗受盐胁迫以及水杨酸的影响程度明显大于掌叶大黄和唐古特大黄种子或幼苗。掌叶大黄和唐古特大黄通常分布海拔高于药用大黄，生境条件更为苛刻，因此前两者可能对环境胁迫表现出比药用大黄更高的耐受性。盐胁迫会导致活性氧等有害物质大量生成，以及细胞膜脂过氧化程度加剧和电解质泄漏等不良生理反应，但植物可通过渗透调节系统和抗氧化物质进行抗氧化防御，清除活性氧物质，防止细胞过度失水，保持生物膜的完整性[24]。SA可降低植物膜的渗透性，提高植物抗氧化酶和非酶类抗氧化系统的活性，减少活性氧数量和缓解细胞的损伤程度[25-26]。但本研究还未测得SA是否提高了3种大黄幼苗中抗氧化酶活性以及所含抗氧化物质含量的差异，关于外源SA增强3种大黄种子及幼苗的耐盐胁迫机制尚不清楚，后续还需要更进一步的深入研究。