微小RNA-625-3P与结肠癌患者病理学特征及预后的关系

刘云，徐亚飞，许慧颖

结肠癌属于临床常见的消化道恶性肿瘤，近年来发病率和死亡率显著升高，目前结肠癌患者5年生存率低于60%，对患者生命安全和身心健康产生严重的影响，因此对于结肠癌早期明确诊断、了解分期和分化程度对评估患者预后、指导临床治疗具有重要的意义[1]。

微小RNA(microRNA, miRNA)一般是指21～25个核苷酸组成非编码RNA，可以通过和信使RNA结合造成信使RNA降解或者阻断其翻译过程，对细胞分化、增殖与凋亡具有调控作用，并在胃癌、鼻咽癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤表达异常提示miRNA在恶性肿瘤的发生、发展、侵袭与转移过程中发挥重要的作用[2]。既往研究[3]发现 miR-625-3p能影响奥沙利铂对结肠癌患者的疗效，而且miR-625-3p能促进结肠癌细胞的侵袭和转移，同时也发现在恶性胸膜间皮瘤患者血循环中 miR-625-3p水平升高。然而miR-625-3p在结肠癌的发生发展中的作用仍不明确，值得进一步研究和探讨。本研究分析了本地区结肠癌术后患者微小RNA-625-3P同病理学特征及预后的关系，目的是为结肠癌治疗和评估疗效提供依据，现汇报如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性选取廊坊市人民医院2014年1月～2017年1月收治的结肠癌患者166例，其中男98例，女68例，年龄43～78岁，平均(58.37±2.96)岁。纳入标准：①均行结肠癌根治手术，术后病理学确诊结肠癌；②术前未接受放化疗、生物药物治疗等；③临床资料完整；④术后自愿配合随访。排除标准：①合并心、肝、肾等重要脏器功能障碍；②复发性结肠癌；③合并其他部位原发性恶性肿瘤。本研究已获医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将安徽省生化药物工程技术研究中心冻存提供的细胞复苏，复苏后于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中，置于 37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内传代培养，待细胞生长状态良好时用于实验。

1.2.2 RNA 提取和 qRT-PCR 利用TRIzol试剂分别提取结肠癌、结肠癌毗邻正常组织(癌旁组织)、SW480和SW620细胞中的总RNA。取含100 ng总RNA按iScript TM cDNA Synthesis Kit 操作说明书进行反转录cDNA。按TaqMan MicroRNA Assays 说明检测成熟 miRNA，以 miR-625-3p 和 U6 为模板，miR-625-3p 和 U6 荧光探针作引物扩增，miR-625-3p上游引物：5′-CAACGAGTCCTAACAGTCTGCTGAG-3′，下游引物：5′-TATCCTrGAGGGTCCGAGGTATTC-3′；内参U6上游引物：5′-CATTGGCTFCGGCAGCACATATAC-3′，下游引物：5′-CAGGCTTGAA7ITrGCGTGTCATCC-3′。在ABI StepOneTM Real-Time PCR System 中进行反应。所有实验重复 3 次，相对定量用 2-ΔΔCt法来分析real-time PCR的结果。

1.3 观察指标及评价标准

术后通过门诊、住院复查和电话等形式进行随访。无进展生存期(Progression-free survival, PFS)是指患者从首次治疗到观察到有客观证据证实的疾病进展的时间间隔；总生存期(Overall survival, OS)患者首次治疗到由于任何原因死亡的时间。在随访截止日期仍存活的患者将以随访截止日期作为截尾数值进行分析[4]。

TNM分期依据国际抗癌协会(Union Internationale Contrele Cancer，UICC)提出的专门用来在癌症治疗过程中确定肿瘤病变范围的分类方法，T表示原发肿瘤大小和范围，N代表区域淋巴结，反映与肿瘤有关的淋巴结转移情况， M表示远处转移情况，用TNM三个指标的组合划分出不同的时期[5]。

肿瘤浸润是指病理学检查发现在肿瘤周围以及癌旁组织，均可存在肿瘤细胞的浸润、渗透，也与恶性肿瘤细胞的活跃程度和侵袭能力密不可分[6]。

肿瘤分化是根据肿瘤组织的间变程度，包括癌细胞的分化程度、排列方式、核分裂数量及局部浸润程度等加以确定的，分为高分化、中分化、低分化，分化程度越低恶性程度越高[7]。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 miR-625-3p在结肠癌组织中的表达

检测结果显示，166例患者结肠癌组织与癌旁组织miR-625-3p相对表达水平为0.64(0.44,1.10)与0.36(0.20,0.55)，结肠癌组织miR-625-3p表达量比癌旁组织明显升高(P<0.05)，见图1、图2。

图1 miR-625-3p 在结肠癌组织与癌旁组织的表达水平比较

图2 内参U6与 miR-625-3p 在结肠癌组织与癌旁组织的扩增曲线 (横坐标为PCR扩增的轮数，纵坐标是浓度)

2.2 结肠癌miR-625-3p的表达与临床病理参数的关系

以miR-625-3p均值为临界值，将患者分为高表达组(n=98)和低表达组(n=68)。高表达组低分化、浸润程度T3～T4、TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴结转移占比高于低表达组(P<0.05)，见表1。

表1 结肠癌miR-625-3p的表达与临床病理参数的关系

2.3 不同miR-625-3p表达水平的结肠癌患者预后

图3 不同miR-625-3p表达水平结肠癌患者PFS时间

2.4 不同临床病理参数患者预后比较

TNM分期Ⅲ～Ⅳ、有淋巴结转移、miR-625-3p低表达患者5年总生存率明显低于TNM分期Ⅰ～Ⅱ、无淋巴结转移、miR-625-3p低表达患者(P<0.05)，见表2。

图4 不同miR-625-3p表达水平结肠癌患者OS时间

2.4 结肠癌患者预后的影响因素

以患者的预后结局作为因变量，以TNM分期(Ⅰ～Ⅱ=0、 Ⅲ～Ⅳ=1)、淋巴结转移(否=0、是=1)、miR-625-3p(低表达=0、高表达=1)作为自变量，建立多因素Cox比例风险模型，结果显示， TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、发生淋巴结转移、miR-625-3p高表达水平均是影响结肠癌患者预后的独立危险因素(P均<0.05)，见表3。

表2 不同临床病理患者预后比较

表3 结肠癌患者预后的影响因素

3 讨论

结肠癌属于国人中常见的恶性肿瘤之一，目前结肠癌发病在所有恶性肿瘤位居第五位，虽然随着治疗手段的进步但是结肠癌患者死亡率仍居高不下，有学者报道结肠癌患者预后取决结肠癌进展情况等多种因素，因此对结肠癌发生机制和新靶点治疗已成为临床热点研究话题[8]。微小RNA是22个核苷酸组成的非编码单链RNA，可以在转录后调节基因表达过程，一个微小RNA可以靶向多个信使RNA，构成生物信息中复杂的网络，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用[9]。近年来研究发现AXL( Anexelekto)属于受体酪氨酸激酶亚家族成员之一，可以同配体结合可激活AXL 的酪氨酸激酶活性，激活下游信号转导途径，参与细胞黏附与识别、细胞增殖、抗凋亡、凝血、炎症反应等过程[10]。

本研究分析的miR-625-3p基因已证实可以直接作用在AXL中对肿瘤增殖、侵袭和迁移发挥调控作用，但是在结肠癌报道研究相对较少[11]。本研究中结肠癌组织miR-625-3p相对表达水平高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示结肠癌组织中miR-625-3p表达升高，既往研究证实该基因在非小细胞肺癌中表达升高，可以作为预测肺癌发生发展，同本研究结果一致[12]。本研究还显示，在低分化、浸润程度T3～T4、TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴结转移结肠癌患者中miR-625-3p表达更高，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明miR-625-3p表达与结肠癌发病病理生理相关，可能是促进肿瘤细胞发生增殖、侵袭转移的重要因素[13]。研究发现肿瘤的细胞特征表现为侵袭转移和具有无限的复制能力，细胞周期是维持细胞正常活动的过程，肿瘤细胞周期出现异常，通过阻滞细胞周期可以发挥抗肿瘤作用[14-15]。目前有报道指出应用miR-625-3p抑制剂后细胞G0/G1期比例显著升高，S期细胞减少，因此细胞增殖速度下降，提示了miR-625-3p抑制剂能够抑制肿瘤细胞增殖，也进一步印证了miR-625-3p抑制剂对肿瘤细胞周期产生影响对肿瘤细胞增殖发挥阻滞效果，也侧面提示了miR-625-3p对细胞周期的转换具有促进作用[16-19]。

本研究中miR-625-3p高表达患者PFS时间和5年无进展生存率同低表达患者之间存在差异性，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示对患者预后具有一定的预测价值。进一步建立Cox模型发现TNM分期、淋巴结转移、miR-625-3p表达水平是结肠癌患者预后的独立影响因素(P<0.05)。还有研究证实了miR-625-3p可以促进B淋巴细胞瘤-2基因表达，后者属于抗凋亡蛋白，一般在结肠癌肿瘤细胞中呈现高表达状态，可以调控结肠癌细胞增殖过程，通过使用miR-625-3p抑制剂则可以抑制促凋亡蛋白BCL2-Associated X蛋白的表达，后者可以通过细胞色素C途径对半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族进行激活，造成结肠癌细胞发生凋亡。巴一等[20]分析了结肠癌组织与对应正常结肠组织微小RNA(miRNA)的表达特征和诊断情况，发现6例结肠癌及其癌旁结肠组织中存在132种miRNA，其中47种miRNA在结肠癌发生过程中表达量显著下降，应用PAM法对9对结肠癌组织/远端正常结肠组织进行定性判断的结果与病理切片诊断结果基本一致，提示了miRNA与结肠癌的发生发展有密切的联系。

本研究分析了miR-625-3p在结肠癌肿瘤细胞中的表达情况，重点观察了该基因同患者预后具有密切关系，分析了可能影响肿瘤发生、发展的机制，为结肠癌靶向治疗、评价预后提供了的新的证据。但是由于纳入病例数量少，而且选择的样本人群可能存在一定的偏倚，而且由于肿瘤调控的信号途径复杂，目前在肿瘤微环境miR-625-3p发挥的调节机制尚未完全明确，还需要进一步扩大样本量、通过分子生物学、细胞学研究进一步论证。

综上所述，结肠癌组织中miR-625-3p高表达，与TNM分期、淋巴结转移等临床特征密切相关，共同影响患者预后。