白杨素对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织COX-2和NOS表达的影响*

樊荣，李龙，乔中原，王俊平，张琪，马磊

1西安市第一医院麻醉科，陕西 西安 710002；2西北大学附属第一医院；3西安交通大学第二附属医院麻醉科

近年来随着人们饮食结构和生活方式的改变，心肌梗死发生率逐年升高［1］。心肌梗死特别是急性心肌梗死多数需手术治疗，而在溶栓或经皮冠状动脉介入治疗中患者有可能发生心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI），这是导致患者发生死亡的原因之一，而减少MIRI的发生是当前医学界急需解决的问题［2］。白杨素学名5，7-二羟基黄酮，是蜂胶的主要有效成分，研究显示［3］，白杨素具有抗炎、抗氧化、抗癌等药理活性，此外还有研究报道［4］其对脑MIRI具有治疗作用。近年来研究发现黄酮类药物在预防MIRI中具有良好疗效［5］，但关于同样为黄酮类药物的白杨素对MIRI的研究国内还没有相关研究报道，为此本研究从环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的表达尝试探讨白杨素对MIRI的保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物60只健康清洁级雄性SD大鼠，购于西安交通大学医学院动物实验中心，动物合格证号SYXK（陕）2018-001，饲养环境：湿度40%～60%，温度22～26℃，光照/黑暗=12 h/12 h。

1.2 药物与试剂白杨素（纯度98%，CAS编号：480-40-0，陕西慈缘生物技术有限公司）；雷米普利（昆山龙灯瑞迪制药有限公司，国药准字H20030723，规格：1.25 mg×14片×2板/盒）；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）试剂盒（武汉华美生物科技公司，货号分别为：CSB-E11987r、CSBE08055r和CSB-E04595r）；环氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（Abcam公司，货号分别为：ab283593、ab236134和ab245355）；辣根酶标记的二抗（武汉谷歌生物，货号：G1213-100UL）；引物购于上海生物生工。

1.3 仪器C8000型全自动生化分析仪（美国雅培公司）；Infinite F50型酶标仪［勒菲生物科技（上海）有限公司］；TDL80型低温高速离心机（德国BC公司）；DW-HL678型超摄氏度超低温冰箱（美菱生物医疗）；BR型凝胶电泳仪系统（美国Bio-Rad公司）；QuantStudio 3型实时荧光定量PCR仪（赛默飞世尔中国）。

1.4 动物实验

1.4.1 分组及治疗按照随机数字表法将60只SD大鼠分为假手术组、模型组、雷米普利组及白杨素低、中、高剂量组，每组10只。各组均预防治疗1周，其中假手术组和模型组灌胃1.0 mL/（kg·d）生理盐水，雷米普利组灌胃雷米普利1.0 mL/（kg·d），白杨素低、中、高剂量组分别灌胃白杨素10、20和40 mL/（kg·d）。

1.4.2 MIRI模型构建根据文献报道方法［6］构建MIRI动物模型，大鼠于手术前日分批次禁食不禁水12 h，于次日9点到下午4点构建模型。将大鼠采用5 mL/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后行气管插管，连接小动物呼吸机，监测心电图；沿左侧胸第三和第四肋骨间行开胸手术并暴露心脏，先在左心耳1～1.5 mm处进针，左前降支后出针，拉紧结扎线，当肉眼可见左心室苍白明显，心电图ST段抬高即缺血造模成功。结扎30 min后恢复供血120 min，实现再灌注损伤。假手术组只穿线不结扎。

1.4.3 心肌组织和血液收集方法MIRI模型构建成功后采用股动脉取血法收集血液，置入抗凝管中保存备用，后取出心脏，将心脏横切成二部分，一部分置于组织固定液中用于检测心肌组织病理学，一部分置于超低温冰箱中用于蛋白和mRNA检测。

1.5 检测指标

1.5.1 生化指标检测由广西中医药大学附属瑞康医院检验科完成心肌酶谱指标肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes，CK-MB）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、血浆肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnI）及血清和心肌组织炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-10水平检测。

1.5.2 心肌组织病理学检测采用苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin，HE）观察心肌组织病理学，具体操作按照文献报道［7］方法进行，从固定液中取出心脏组织，依次经自来水反复冲洗、石蜡包埋、切片（5 μm左右）、洗涤、苏木精染色、伊红复染、脱水、封片，图片采集用荧光倒置显微镜，每张切片选取4个不同视野。

1.5.3 COX-2与NOS蛋白表达检测采用蛋白印迹法（Western Blotting）观察心肌组织COX-2和NOS蛋白表达，称取100 mg心肌组织用组织裂解液裂解后提出上清BCA法定量后调平，每组各取50 μg行SDS-PAGE凝胶电泳，完成后裁剪目的蛋白转移到PVDF膜，采用5%脱脂牛奶封闭2 h后，加入1抗孵育（COX-2为1∶1000，NOS为1∶2000；GAPDH为1∶3000），洗涤3次后加入2抗孵育（1∶3000），再次洗涤3次后暗室ECL法曝光洗片。以所测指标条带灰度值与GAPDH条带灰度值比值作为蛋白相对表达量，每组实验重复3次。

1.5.4 COX-2与NOS的mRNA检测采用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测心肌组织COX-2和NOS的mRNA表达，称取20 mg心肌组织，总RNA提取试剂盒提取总RNA后每组各取2 μg逆转录为cDNA，后行扩增反应，扩增条件：94℃预变性5 min，95℃变性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸30 s，共进行35个循环，以GAPDH作内参，结果采用2-△△Ct法比较分析。引物序列为COX-2上游引物：5'-CGTAGCTTGAGGCAGAGTGACTGC-3'，下 游 引物：5'-GATTTGGCGATT-GCTGCTCAGCT-3'，产物长度：102 bp；NOS上 游 引 物：5'-TCCATGGGTTTGCCACACTC-3'，下游引物：5'-AAGAGCCAAGCAAAGGCGA-3'，产物长度：94 bp；GAPDH上游引物：5'-GGACTAGCTACTGACCCTC-3'，下游引物：5'-TACCCTGGCTCTTTGAT-3，产物长度：117 bp。

1.6 统计学方法采用SPSS 22.0分析数据，计量资料以±s表示，采用t检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 心肌组织病理学假手术组心肌纤维排列整齐，纤维大小基本均一，模型组出现明显心肌纤维断裂，排列无次序，相较于模型组，各治疗组心肌纤维均好转，但较假手术组差。白杨素中、高剂量组效果好于雷米普利组。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色结果（×400）

2.2 心功能与假手术组相比，模型组CK、CK-MB、LDH和cTnl均升高（P＜0.05）；各治疗组CK、CK-MB、LDH和cTnl较模型组降低（P＜0.05）。白杨素中、高剂量组与雷米普利组比较差异无统计学意义（P＞0.05），白杨素低剂量组差于雷米普利组，且除cTnl外，其余各组差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清心肌酶学指标比较（±s）

表1 各组大鼠血清心肌酶学指标比较（±s）

注：*表示与假手术组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与雷米普利组比较，P＜0.05

组别假手术组模型组雷米普利组白杨素低剂量组白杨素中剂量组白杨素高剂量组鼠数10 10 10 10 10 10 CK（U/L）315.21±37.83 1736.90±265.35*1267.26±165.38#1379.51±185.31#△1276.54±158.25#1242.68±148.68#CK-MB（U/L）204.74±18.48 1307.25±265.38*926.37±176.58#1034.51±135.86#△936.21±117.32#921.53±119.28#LDH（U/L）558.29±160.21 1704.18±369.13*1138.26±204.82#1283.24±189.31#△1205.33±147.35#1162.16±180.17#cTnl（ng/mL）0.83±0.08 1.36±0.20*1.02±0.08#1.07±0.11#1.05±0.12#1.04±0.08#

2.3 心肌和血清中炎性因子与假手术组比较，模型组血清和心肌组织TNF-α和IL-1β均升高（P＜0.05），IL-10降低（P＜0.05）；各治疗组TNF-α和IL-1β低于模型组（P＜0.05），IL-10高于模型组（P＜0.05）；白杨素低剂量组对心肌组织TNF-α影响差于雷米普利组（P＞0.05）。见表2—3。

表2 各组大鼠血清炎性因子比较（±s） ng/mL

表2 各组大鼠血清炎性因子比较（±s） ng/mL

注：*表示与假手术组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05

组别假手术组模型组雷米普利组白杨素低剂量组白杨素中剂量组白杨素高剂量组鼠数10 10 10 10 10 10 TNF-α 0.14±0.02 0.42±0.01*0.27±0.02#0.28±0.01#0.25±0.01#0.25±0.01#IL-1β 0.25±0.03 0.82±0.05*0.51±0.04#0.56±0.04#0.54±0.01#0.52±0.05#IL-10 0.12±0.03 0.07±0.02*0.11±0.02#0.09±0.03#0.09±0.02#0.10±0.02#

2.4 相关酶蛋白表达与假手术组相比，模型组COX-2和NOS蛋白及mRNA表达均升高（P＜0.05），而各给药组COX-2和NOS蛋白及mRNA表达均降低（P＜0.05）；白杨素高剂量组COX-2蛋白及mRNA表达低于雷米普利组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4及图2。

图2 各组大鼠心肌组织中COX-2和NOS蛋白表达

表4 各组大鼠心肌组织中COX-2和NOS蛋白及mRNA相对表达结果（±s）

表4 各组大鼠心肌组织中COX-2和NOS蛋白及mRNA相对表达结果（±s）

注：*表示与假手术组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与雷米普利组比较，P＜0.05

组别假手术组模型组雷米普利组白杨素低剂量组白杨素中剂量组白杨素高剂量组鼠数10 10 10 10 10 10 COX-2蛋白0.35±0.07 0.92±0.16*0.65±0.13#0.79±0.10#△0.61±0.15#0.45±0.11#△mRNA 1.00±0.00 2.87±0.37*1.74±0.21#1.92±0.25#△1.77±0.22#1.63±0.16#△NOS蛋白0.31±0.05 0.80±0.13*0.55±0.07#0.67±0.14#△0.61±0.12#△0.57±0.11#RNA 1.01±0.01 2.52±0.48*1.65±0.17#1.86±0.23#△1.82±0.18#△1.65±0.13#

表3 各组大鼠心肌组织中炎性因子比较（±s） ng/mL

表3 各组大鼠心肌组织中炎性因子比较（±s） ng/mL

注：*表示与假手术组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与雷米普利组比较，P＜0.05

组别假手术组模型组雷米普利组白杨素低剂量组白杨素中剂量组白杨素高剂量组鼠数10 10 10 10 10 10 TNF-α 0.58±0.06 1.27±0.16*0.71±0.09#0.82±0.12#△0.76±0.09#0.73±0.11#IL-1β 1.23±0.14 2.94±0.36*1.95±0.17#2.08±0.18#1.96±0.17#1.97±0.24#IL-10 0.36±0.07 0.20±0.12*0.28±0.06#0.26±0.08#0.26±0.07#0.25±0.06#

3 讨论

对于急性心肌梗死患者及时进行溶栓治疗以实现血流恢复灌注是主要的治疗手段，但手术中不可避免会出现再灌注损伤，严重影响患者预后［8］。再灌注过程中包括氧化应激、炎症刺激以及继发性心肌细胞凋亡等均是本病进展和发生的关键，为准确模拟临床中MIRI特点，本研究依据文献［9］采用左冠状动脉前降支结扎方法构建心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，造模方法相对简单，且成功率高，术中死亡率低，与临床中MIRI有相似性。本研究病理学结果显示，假手术组心肌纤维排列整齐，模型组出现明显纤维断裂，证实造模成功，白杨素预防治疗组均好转，白杨素中、高剂量组在改善心肌病理学方面优于雷米普利组，提示白杨素预防给药可改善MIRI带来的心肌损害且相较于雷米普利有一定优势。

近年来植物被开发应用于心脑血管疾病的预防［10］。大量研究证实黄酮类药理活性极高，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性，对糖尿病、动脉粥样硬化、脂肪肝病等多种疾病有较好疗效［11］。白杨素是天然黄酮类化合物的一种，其主要存在于西番莲属植物中，在蜂胶中大量存在。近年来研究发现，白杨素可促进肿瘤细胞凋亡，保护糖尿病肾脏和心肌损伤，对脑缺血再灌注损伤具有明显作用［12-13］。本研究结果显示与模型组相比，白杨素各剂量组心肌酶指标CK、CK-MB、LDH和cTnl均降低，进一步证实了白杨素对MIRI大鼠心肌的保护作用。

在介导MIRI的多种因子中，炎症反应是核心，而在MIRI炎症反应中，中性粒细胞又在其中扮有重要角色［14］。在MIRI发生过程中，中性粒细胞可被激活并黏附于心肌血管内皮细胞，进而导致内皮细胞水肿，发生功能障碍，最终导致细胞凋亡［15-16］。在这一过程中，中性粒细胞诱发的花生四烯酸大量产生，并参与炎症过程，其中COX-2是主要限速酶，可控制花生四烯酸的产生量，而NOS主要参与炎症产生后心肌的整个损伤过程［17-18］。此外一些炎性因子如TNF-α、IL-1β和IL-10也参与了炎症反应整个进程，TNF-α是炎症级联反应的关键因子，其主要作用为心肌收缩，诱导多种炎症因子产生，最终促进细胞凋亡［19］。IL-1β主要由巨噬细胞产生，其可介导中性粒细胞与血管内皮细胞结合，也可促进中性粒细胞在内皮细胞转移，最终加剧炎症进而促进血管堵塞。细胞因子IL-10是一种抑制炎症产生因子，其可在心肌损伤中降低炎症因子产生［20-21］。本研究采用白杨素治疗MIRI大鼠后发现，与模型组相比，白杨素各剂量组血清和心肌组织TNF-α和IL-1β降低，IL-10升高，COX-2和NOS蛋白及mRNA表达降低，提示白杨素对MIRI大鼠心肌组织炎性因子的产生具有抑制作用，低剂量组对TNF-α的影响差于雷米普利，其余相仿。

本研究结果显示白杨素预防给药可减弱MIRI大鼠心肌损伤，其保护机制可能是通过抑制炎性因子的产生来实现。