复方雷公藤汤最佳剂量配比的正交试验设计及其对雌性肾病大鼠生殖系统减毒增效的作用*

2023-01-04李波金伶佳吴美兰

西部中医药 2022年11期

李波，金伶佳，吴美兰

1大连市皮肤病医院，辽宁大连 116021；2大连市中心医院；3大连市中医医院

雷公藤是一种作用广泛、疗效独特而毒性较大的药物，治疗类风湿关节炎有独特疗效［1］，对各种肾病、慢性肾炎有较好的降低尿蛋白、保护肾功能作用，但又对多系统、多脏器有损害，对生殖系统的损害尤为突出，可引起女性患者月经紊乱，甚至继发卵巢早衰［2］。许多难治性疾病采用雷公藤治疗，疗效显著，但有较大副作用［3］。本研究采用正交试验设计方法，对雷公藤汤复方进行最佳剂量配比研究，以期更好地指导临床用药［4］。

1 材料与方法

1.1 实验动物普通级7～8周龄Wister雌性大鼠90只，体质量（200±10）g，均未曾交配，由辽宁中医药大学实验动物中心提供，动物实验合格证号：SCXK（辽）2018-0209。

1.2 药物与试剂中药雷公藤（福建）为卫矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.全株，制何首乌（四川）为蓼科多年生缠绕草本植物何首乌Polygonum multiflorumThunb.的块根，当归（甘肃）为伞形科多年生草本植物当归Angelica sinensis Diels的根，甘草（内蒙）为豆科多年生草本植物Glycyrrhiza glabraL.的根及茎，均购于大连同仁堂药房。注射用盐酸阿霉素（浙江海正药业股份有限公司，批号：180916，规格：10 mg/支）。电化学发光试剂盒（南京建成生物公司，批号：20180827）。

1.3 主要仪器ES-J系列电子分析天平（沈阳龙腾电子称量仪器公司）；3-16K型冷冻离心机（Sigma）。

1.4 方法

1.4.1 造模与分组参照BERTANI T等［5］方法，模型组大鼠在非麻醉下按6.5 mg/kg（体质量）一次性尾静脉注射阿霉素复制肾病模型。造模3天后大鼠逐渐出现食欲减退、行动迟缓、皮毛无光泽、厮咬、烦躁、腹水情况，造模第7天后用代谢笼收集大鼠24 h尿液，尿蛋白定量呈渐进性增多，提示造模成功。造模成功后按完全随机化原则将大鼠分为9组各10只，分笼饲养。

1.4.2 正交试验设计复方雷公藤汤中雷公藤为君药，臣为制何首乌、当归，使为甘草。4味中药按体表面积换算法，D鼠＝D人×R鼠/R人，确定各味药的剂量，高、中、低剂量雷公藤分别为120、90、60 g，何首乌分别为72、54、36 g，当归分别为72、54、36 g，甘草分别为60、36、12 g。每味药为1个因素，共有4个因素，每个因素采用高、中、低3个剂量即3个水平，即L9（34）正交表［6］。见表1。

表1 正交试验因素水平

1.4.3 动物给药复方雷公藤汤不同剂量组方各加水2000 mL，雷公藤先煎1 h后下诸药，常规煎煮2次，去药渣后合并药液，浓缩成300 mL。各组大鼠从造模第15天起经口灌药2 mL，每日1次，连续给药14天。

1.5 观察指标

1.5.1 性激素打开腹腔，剥离脏器，暴露腹主动脉，用10 mL注射器抽取6 mL动脉血，离心半径10 cm，3000 r/min离心10 min，分离血清后按电化学发光试剂盒说明书测定促卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2）含量。

1.5.2 24 h尿蛋白定量治疗14天后用代谢笼收集各组大鼠24 h尿液，测24 h尿蛋白定量。

1.6 统计学方法采用SPSS 20.0软件分析数据，使用正交试验设计助手3.1，按正交表L9（34）四因素三水平安排试验，通过直观、极差及方差分析筛选最佳剂量配比。

2 结果

2.1 性激素复方雷公藤汤不同剂量配比对肾病大鼠血清雌二醇影响由大到小依次为雷公藤＞当归＞甘草＞制何首乌，卵泡刺激素由大到小依次为雷公藤＞当归＞甘草＞制何首乌，黄体生成素由大到小依次为雷公藤＞当归＞甘草＞制何首乌。方差分析显示［7］，雷公藤（A）、制何首乌（B）、当归（C）、甘草（D）各组比较差异均具有统计学意义，综合直观分析和方差分析结果，确定A3B2C1D3为最佳配比剂量。其中雷公藤对雌性肾病大鼠生殖系统E2、FSH、LH影响较大。见附表1及表2—4。

表2 E2方差分析

表3 FSH方差分析

表4 LH方差分析

2.2 24 h尿蛋白定量复方雷公藤汤不同剂量配比对肾病大鼠24 h尿蛋白影响由大到小依次为雷公藤＞甘草＞制何首乌＞当归。方差分析显示，雷公藤（A）、制何首乌（B）、甘草（D）比较差异均具有统计学意义，当归（C）无统计学意义。综合直观分析和方差分析确定A1B3C3D3为最佳配比剂量。其中雷公藤与甘草影响较大，制何首乌影响较小，当归无影响。见表5—6。

表5 24 h尿蛋白定量直观分析（±s）

因素复方雷公藤汤1号复方雷公藤汤2号复方雷公藤汤3号复方雷公藤汤4号复方雷公藤汤5号复方雷公藤汤6号复方雷公藤汤7号复方雷公藤汤8号复方雷公藤汤9号尿蛋白mg/24 h K1 K2 K3 R雷公藤（A）1 1 1 2 2 2 3 3 3 147.1 238.2 261.3 114.2制何首乌（B）1 2 3 1 2 3 1 2 3 223.6 202.5 220.5 21.1当归（C）1 2 3 2 3 1 3 1 2 214.4 220.3 211.9 8.4甘草（D）1 2 3 3 1 2 2 3 1 228.3 224.3 194.0 34.3 24 h尿蛋白定量（mg/24 h）55.60 49.20 42.30 76.50 78.10 83.60 91.50 75.20 94.60

表6 24 h尿蛋白定量方差分析

3 讨论

近年来，中药临床用药的安全性问题受到广泛关注，同时也是中医药走向世界的主要壁垒［8］。历代医家采用配伍、炮制、调整用量等方法对有毒中药实施减毒增效，而其中配伍减毒法又派生相杀、调和、佐制、扶正等减毒法，以及基于中医基础理论进行性味归经的配伍减毒［9］。复方雷公藤汤据诸法组合而成，方含雷公藤、制何首乌、当归、甘草，功用益气养血，解毒化浊，利水消肿。以雷公藤活血解毒、消肿除湿为君。制何首乌、当归补气血扶正，益精血，以防雷公藤戕伐之害，为臣药。甘草补中益气扶正，解药毒缓君药之性，可调和诸药，为使药。甘草是最常用的中草药之一，具清热解毒、保肝抗炎和调和诸药等功效。前期复方雷公藤汤及拆方对肾病大鼠心脏的减毒增效作用研究结果表明雷公藤配伍后可减低其对心脏毒性的作用［10］。

本研究结果表明，在降低雌性肾病大鼠生殖系统影响因素方面，复方中雷公藤影响最大，其生殖系统毒性随雷公藤剂量增加而增高，当归对减低肾病大鼠生殖系统毒性有较大影响，何首乌和甘草对减低肾病大鼠生殖系统毒性有作用，但影响较小，因此确定A3B2C1D3为最佳剂量配比，提示临床女性患者服用雷公藤治疗疾病时，可采用这种剂量配比来减低生殖系统毒性。减少肾病大鼠24 h尿蛋白方面，复方雷公藤汤中雷公藤具有最大影响作用，其作用随雷公藤剂量加大而增高；甘草也有较大影响，采用低剂量甘草效果优于高剂量，制何首乌对降低肾病大鼠24 h尿蛋白有作用，但影响较小，因此确定A1B3C3D3为最佳剂量配比，提示临床治疗肾病时可采用这种剂量配伍来减少肾病患者24 h尿蛋白。

雷公藤对女性患者的副作用临床主要表现为月经紊乱、闭经、卵巢早衰和性功能减退等，青春期及育龄女性患者在服用雷公藤治疗疾病时要综合考虑用药剂量及周期，安全合理用药，需控制其含有量、用药剂量、时间，从而降低风险，达到安全有效的用药目的［11］。

目前中药减毒实践中应用最为有效和广泛的方法是炮制及配伍减毒法，结合细胞模型和体内代谢组学研究，对临床合理用药具有重大意义［12］。要在中医药辨证论治和整体观念的指导下，先通过化学分析方法检测雷公藤配伍前后有效成分与毒性成分的含量变化，再结合动物实验的药效与毒效研究，开展雷公藤配伍减毒机制研究，筛选出雷公藤的毒效关系最优化的中药小复方，以提高肾病、皮肤病、类风湿关节炎等难治疾病的疗效［13-14］。下一步，在人体、动物模型和细胞3个层次，蛋白、基因和转录调控多个水平开展雷公藤及其提取物治疗各种疾病的机制研究，深入了解雷公藤治疗疾病的机制［15］，为雷公藤相关制剂的开发和应用提供依据［16］。