高效液相色谱法在中药成分定量分析中的研究进展*

梁雨彤，戴临风，郭瑞怡，马雪晴，郑莘栎，冯月男

（1.黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学 实验实训中心，黑龙江 哈尔滨 150040；

3.黑龙江省医院，黑龙江 哈尔滨，150036）

前 言

高效液相色谱法（HPLC）是一种早在20世纪60年代末期被科学家们所研究发明，自1971年开始崛起的分离分析技术[1]，近几十年迅速发展。相比于经典气相色谱法与经典液相色谱法，HPLC具有高效，高准确度，高灵敏性的特征，可以大大缩短分析的周期。现今，中药作为现今中国的研究重点，不仅成分庞杂，而且多种成分作用机制与疗效复杂。HPLC是中药类制剂在质量检验中常用的一种方法，能够准确判定中药制剂质量是否符合标准以及中药稳定性的高低，因此高效液相色谱法测定中药制剂有效成分含量是确保中药制剂质量的重要方法之一，对于中药成分的分析起到了重要的作用，并且HPLC被广泛应用于中药分离、纯化中。从最新颁布实施的《中国药典》2020年版来看，一部、二部采用HPLC法的品种分别占总数的66%和72%。由此得出，当前HPLC法已成为《中国药典》中最常用的检测方法[2]。而目前关于HPLC应用于中药的综述却很少。笔者通过查阅近十年的文献对HPLC应用于中药领域进行全面的综述。

1 高效液相色谱法的原理

HPLC原理为通过高压输液系统将多种流动相带入到色谱柱中，因为样品中的不同成分在固定相中具有不同的分配系数，在流动相与固定相中进行多次的吸附与解吸历程，以单个组分的形式通过不同类型的检测器和现代数据处理系统可视化地变为图谱数据供研究者们所参考。根据固定相和流动相的不同特性可分为不同的分离模式。更需注意的是，选择合适的分离模式和不同的检测器是实验研究成功至关重要的一步。

1.1 高效液相色谱法的分类及其原理

目前主流的高效液相色谱主要分为以下几类：液-液分配色谱法，液-固吸附色谱法，离子交换色谱法，离子色谱法，离子对色谱法和空间排阻色谱法。其中有四类已被广泛地应用于科学研究中：液-液分配色谱法主要根据被分离物质的溶解度不同，从而达到分离的目的；液-固吸附色谱是根据两种不相溶的溶液之间的分配系数不同来进行分离，是目前应用最广泛的分离模式；离子交换色谱法根据被分离组分离子交换能力的差别而实现分离的目的；空间排阻色谱法根据分子的大小进行筛选分离。

1.2 高效液相色谱法在中药中的应用原理

由于中药中的许多复杂的天然产物如生物碱、黄酮、香豆素、甾体、皂苷、蒽醌等成分，在中药中含量很少且相对分子质量较大，HPLC具有操作简单，准确度、灵敏度和重现度高的优点，可以达到实验数据准确，节约成本等目的。目前为止，在中药的成分分析与分离中，应用最广泛的是以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相（C18），以一定比例的甲醇-水或乙腈-水为流动相的反向高效液相色谱法（RP-HPLC）。

2 高效液相色谱法在中药成分中的应用

中药产品品种极为复杂，HPLC可通过分离对中药有效成分进行定量的分析。针对于中药指纹图谱的应用、中药成分的鉴定、测定等方面的应用笔者进行了综述。与此同时，针对于不同的联用手段，对于中药的质量控制与成分分析方面都做出了卓越的贡献也进行了分析。

2.1 HPLC在中药指纹图谱中的应用

中药指纹图谱针对产地、种植条件等多种因素不同的同种中药提供了很大的包含性，对不同影响因素提供了参考，为后续的中医药生产、质量分析等方面有很大的实用意义。由于提取物质量有所参差,缺乏规范标准，企业在使用时面临较大的质量风险，因此建立一种准确、全面的内控质量评价方法尤为关键。可以通过已知的指纹图谱，利用实验中有效成分的重现性对中药进行质量监控。因此，HPLC在中药成分分析中提供了重要依据。王书云[3]等建立了五味子的指纹图谱，通过对中药指纹图谱的相似度评价，对五味子的15批样品进行了HPLC分析，质量评测，并后续应用于五味子药材的成分鉴别和质量控制。贾玮娟[4]等对不同来源的猪苓药材及饮片样品进行分析，首次将HPLC特征图谱与指纹图谱相结合，应用于猪苓真伪鉴别和质量评控，为建立系统完善的猪苓质量标准提供了新方法。郭秀洁[5]等通过酸枣仁水提物HPLC定量指纹图谱方法,共标定了8个共有峰，与此同时，运用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱数据解析和超高效液相色谱-三重四极杆质谱得到了10种成分的半定量与定量数据。现今，关于复方中药的指纹图谱也开始投入研究，为相关产品的质量控制做出了贡献。夏姗[6]等运用HPLC建立了茵芪肝复颗粒的指纹图谱，同时，利用其指纹图谱可以针对关键成分进行质量控制。汪冰[7]等对小儿解表口服液建立了HPLC的特征图谱，并着重进行4种主要成分含量测定。

2.2 HPLC在中药成分鉴定与测定中的应用

2.2.1 中药的某一成分进行成分含量测定

HPLC通过中药的色谱峰高或色谱面积的参考与对比，可以进行含量的测定。某些药材之间的成分间可进行互相转化，在不了解转化率的情况下，可对其成分进行鉴定并对含量进行测定；也可以用于区别不同产地或不同生产方式对药材的质量影响程度。根据2005年《中国药典》中[8]以乌药醚内酯作为鉴定乌药的有效成分并进行了鉴定与测定。余翠琴[9]等人利用高效液相色谱法更加快速，简便地测定了乌药醚内酯成分在0.051～2.55μg时与峰面积有良好的线性关系。HPLC可以放大某些特性的研究，宋艳秋[10]等人应用HPLC研究中药葛根的微生物转化菌株，通过对比转化产物的图谱，得出了菌株YM3207对中药葛根发生了种类和量的变化，并且葛根素含量有明显的提高。Nguyen Huy Truong[11]等人运用HPLC-UV/CAD测定越南人参中皂苷的含量，提供了目前缺少的人工养殖后的V G皂苷含量这一重要质量指标的资料。赵新红[12]等对于不同中药中的蛇床子素运用水相为0.05%磷酸水溶液进行了含量测定，相比于《中华人民共和国药典》2015版（一部）运用乙醇溶解、超声处理的方法[13]更为节约时间，节省材料。

2.2.2 中药中的多种成分进行成分含量测定

余静[14]等采用了HPLC-U V-M S联用技术对刺五加药材水溶性和脂溶性成分进行了指纹图谱的研究，在脂溶性成分指纹图谱中发现有10个峰是共有的，并很稳定，为共有指纹峰。M S谱图为HPLC补充了更多有关化合物的信息，拥有了更全面的参考。吕金丽[15]等运用HPLC测定了不同产地银杏叶中同种成分的含量测定，并证实黄酮醇苷与双黄酮成分含量存在差异。Li Yanan[16]等运用QuEChERS萃取-高效液相色谱法测定并分离出滑桃树中三种美登素类生物碱。Khan Javed[17]等运用HPLC分离并测定出碱蓬植物中6种可能的化学成分并对不同部位的化学成分的抗氧化活性研究，得出了相关切实可靠的结果。肖丹[18]等运用HPLC-DAD和《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）建立19批不同产地铁线蕨药材（S1～S19）的指纹图谱，得出了有效成分的差异，为药材的质量控制方面提供了参考。由于2020年版《中国药典》中尚未收载赶黄草的质量标准，且地方质量标准不具有专属性，所以史鹏杰[19]等运用HPLC针对赶黄草中四种有效成分进行了鉴定，为此类药材品质评价提供了参考。

2.2.3 应用联用技术对中药进行成分含量测定

尽管HPLC对于定量方面有极大的优势，其在定性领域的劣势需被攻克，可通过与其他分析技术联用，如飞行时间质谱(T O F-M S)、核磁共振(NMR)等。其中与其它的采用分散液-液微萃取法（DLLME）与HPLC-UV联用的分析方法，可用于同一植物中的同分异构的同时测定与分离。Y.hao[20]等人通过此联用技术已对白花蛇舌草与枇杷中两种三萜酸进行了富集与测定。其中高效液相色谱法可以通过选择不同的检测器，应用于中药植物中不同部位主要成分的测定、中药相关成分的测定、中药提取物成分的测定等等方面。如杨晓博[21]等测定了山楂叶中9种酚类的成分在2～500μg/mL之间呈现良好的线性关系、罗珂[22]等人定量分析了银杏中不同位置的单组份双黄酮，并证实了4种成分在各自范围内均有良好的线性关系。张敏敏[23]等人使用离线2D-HPLC-DPPH-ESI-Q-TOF/M S联用技术对金银黄抗氧化成分进行了系统的筛选，并初步鉴定出了12种活性成分，且12种以有机酸类为主，并含有部分黄酮类成分等。Gao Dan[24]等对于废弃的葛根根茎中的有效成分运用HPLC-PDA-ESI-MS/MS方法测定了鉴定出12种化合物，电子分析表明，其主要成分葛根素和大豆苷元可作为抗色素制剂。

2.3 HPLC在中药复方药成分测定中的应用

中药的成分本就复杂多变，而复方药的有效成分并不是中药有效成分的简单叠加。不同的配伍规律对应的是截然不同的成分变化。中药方剂的复杂性取决于组成方剂的药物的组分的复杂性及各成分相互关系的复杂性，也关于方剂与人体相互关系的复杂性[25]。其有效成分的变化与生物活性物质的鉴定也是今后的研究方向之一。敖立实[26]等运用高效液相法测定了黄芩、大黄的含量来控制黄连解毒丸的质量。苏园[27]等运用了HPLC鉴定了双肾活血胶囊中药中丹参酮ⅡA的测定分析。谷娜[28]等运用高效液相色谱法对复方樟脑搽剂中苯酚的含量进行了测定，并测定苯酚的线性范围为4.51～112.8μg/mL；周媛[29]等对妇炎消颗粒中的中芍药苷进行了定量测定；刘养清[30]等运用水提蒸干醇溶法和反高效液相色谱法（R P-HPLC）针对关木通与其不同的配伍中药马兜铃酸A的含量进行了测定，证明关木通与不同中药配伍后马兜铃酸A含量均有着不同程度的降低，得到了趋利避害的研究目的。张俊杰等[31]运用了HPLC法通过对比法测定肝胆消炎片和热感颗粒中绿原酸、黄芩苷的含量，为制剂的质量控制提供了帮助。

3 高效液相法在中药研究中的应用前景

随着中医药科学在国内及国际地位的提升与中药的广泛应用，使得中药有效成分的已知性和精准用药方面的研究有所突破。与此同时，在中药的研究中，传统方法与新方法的有机融合必须有所突破。近年来，高效液相色谱由于其灵敏度高和选择性好及广泛的适用性，可对提取物中的已知、未知结构的成分及其代谢物进行定量分析，因此与质谱联用可对中药成分及其生物样品进行定量分析，使其在中药的研究中得以更广泛的应用，为加快寻找先导化合物提供了一种高效、切实可行的分析方法。高效液相法在搭配不同的检测器、不同的分离模式和运用联用检测技术均扩大了HPLC在中药分析方面的应用。随着技术的不断更新，HPLC的适用范围和分离程度、分析精度都会有提升，在中药指纹图谱的建立，中药成分的鉴定与测定，中药及其复方药的质量检验，中药新型成分的发现等领域均拥有广泛的应用前景。