金黄色葡萄球菌肠毒素B对动物免疫的影响及其作用机制

叶兰，张海波＊，黎力之，郭冬生，金恒，关玮琨*

（1.宜春学院生命科学与资源环境学院，江西 宜春 336000；2.赣州市畜牧业发展和动物疫病防控中心）

葡萄球菌属革兰氏阳性菌，广泛分布于自然界中，仅少数具有致病性，其中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）致病力最强，可分泌超过33种金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxins，SE），如SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEI及类肠毒素G等[1]。SEB毒性和稳定性最强，且不被胰蛋白酶降解，影响机体免疫调节[2]。在SEB刺激下，动物免疫细胞内的髓样分化因子88（myeloid differenttiation factor 88，MyD88）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）发生磷酸化，从而激活IκB激酶（inhibit kappa B kinase，IKK），使核因子-κB（nuclear factor-kappa，NF-κB）获得活性并靶向细胞核，介导白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）和干扰素γ（interferon gamma，IFN-γ）等炎性细胞因子的分泌，引发机体炎症反应[3～4]。另外，SEB可激活免疫细胞内丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）介导的信号级联反应，通过p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）以及细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）途径诱发细胞核内活化T细胞核因子（nuclearfactor of activating T cells，NFAT）和活化蛋白-1（activator protein 1，AP-1）的表达，调控免疫细胞的增殖、分化以及凋亡等反应[5]。因此，本文重点阐述SEB对动物免疫系统的影响，并就其作用机制进行综述，以期在调控动物免疫功能方面提供理论参考。

1 SEB概述

SEB为单链多肽，分子量约28.5 ku，由239个氨基酸残基构成，两个结构域组成其三级结构，分别为N端1～120位残基并包含3个α螺旋和2个β片层的结构域，C端127～239位残基并包含2个α螺旋、2个短β折叠以及2个β片层的结构域[6～7]。这种特殊结构决定了SEB的热稳性以及耐酸性。研究发现，SEB无论是在100℃条件下煮沸30 min，还是在酸性条件下仍具活性，且可抵抗胃肠道中蛋白酶的水解作用[8]。在动物体中，SEB无需抗原递呈细胞（antigen presenting cells，APC）处理，SEBN端结构域的第43～45位、第67位、第89位和第115位残基通过氢键、电荷间及疏水层间相互作用等方式可与APC表面的（major histocompatibility complex，MHC）II类分子非限制性结合；同时，SEB中第20、22、23、177和210位残基组成的较大结构域，以及第60、90和91位残基组成的较小结构域，两者可直接与T细胞受体（T cell receptor，TCR）Vβ链结合形成MHC II-SEB-TCR复合体结构[9]。这种特殊的结合方式使其具有超抗原的功能，少量SEB即可激活大量T细胞，分泌IFN-γ和TNF-α等炎性细胞因子[10]。

2 SEB对免疫的调节作用

SEB属超抗原家族，动物感染后可诱发T细胞大量增殖，以及IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ等细胞因子分泌，造成皮炎和器官损伤等多种炎症疾病。Larcombe等研究发现[11]，感染SA小鼠与对照组相比，小鼠近端小肠损伤程度显著高于对照组。由此可知SEB在SA感染导致的肠道损伤中发挥重要作用。小鼠尾静脉注射2×108CFUs SA 12 h后，脾脏中炎性细胞因子IL-10、TNF-α和IFN-γ水平增加5倍，血清中IL-10、TNF-α和IFN-γ含量亦高于对照组但差异不显著；监测感染8 d后发现感染SA小鼠全部死亡，表明SEB通过激活免疫细胞而诱发大量炎性细胞因子的分泌，加重机体损伤致死[12]。Jorde等发现[13]，过敏原卵清蛋白（ovalbumin，Ova）致敏诱导小鼠气道炎症后，分别用50 ng SEB和500 ng SEB处理小鼠，显著调节呼吸道免疫细胞的积累，增强淋巴细胞的活化，且在500 ng SEB剂量下，IFN-γ、IL-6和TNF-α水平显著提高，加重气道炎症并导致气道高反应性。

SEB亦可使动物免疫细胞对抗原刺激表现出无反应性，从而诱导免疫耐受，影响机体正常的免疫应答。研究显示，经500 ng SEB处理后的小鼠再用Ova致敏，呼吸道中免疫细胞数目显著减少，且促炎因子水平显著降低[13]。将T细胞与SEB活化产生的效应T细胞分别加入刀豆蛋白、脂多糖和IL-2等刺激原共同培养3d，结果显示，T细胞对刺激原的应答反应显著抑制，增殖能力显著降低[14]。将可识别Ova的TM细胞、APC以及SEB共同培养，14 h后用带有Ova的APC再次刺激，TM细胞呈现明显的无反应性[15]。可见，SEB不仅影响正常淋巴细胞对抗原的反应，还抑制TM对抗原再刺激的应答，使机体发生免疫耐受反应，导致动物免疫系统紊乱。

此外，白藜芦醇、小檗碱和儿茶素等外源物质可调控SEB造成的组织器官损伤，保护机体。研究显示，小鼠鼻内和腹腔分别用2 g和5 g SEB处理后，肺部血管渗漏，血清中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ均显著增加，且小鼠全部死亡；但在SEB处理前均灌胃白藜芦醇，小鼠可存活10 d天以上且无明显临床症状，肺部血管渗漏现象显著减少，肺结构正常，同时炎性细胞因子水平降低，显著改善SEB介导的肺损伤[16]。Jiying等发现[17]，小鼠腹膜内注射SEB显著提高血清IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平，引起急性肝损伤，而小檗碱处理后显著降低SEB所诱导的炎性细胞因子水平，减轻肝脏炎症。SEB可引起D-氨基半乳糖盐酸盐（D-galactosamine，D-Gal）致敏小鼠的致死性休克，而研究发现，腹腔注射茶儿酚提取物后可抑制5 g SEB导致的100%致死；小鼠注射5 g SEB、50 g茶儿酚提取物以及D-Gal的混合物，其血液TNF-α、IFN-γ和IL-4水平显著低于对照组[18]。综上所述，在SEB刺激下，动物免疫细胞内促炎信号得以激活，促使大量炎性细胞因子分泌，诱发组织器官损伤，同时通过诱导免疫耐受，破坏机体免疫系统的正常活动，而一些外源物质可减弱SEB引起的组织器官损伤，对动物机体起保护作用。

3 SEB调节机体免疫的作用机制

3.1 SEB对动物NF-κB通路的影响

NF-κB是细胞内重要的转录调节因子，激活后可进入细胞核靶向炎性细胞因子基因启动子区，诱发产生IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α等炎性细胞因子[19]。SEB可刺激多种免疫细胞，激活NF-κB，分泌大量炎性细胞因子，诱发机体组织损伤[5]。MyD88是NF-κB信号传导的关键调节因子之一，参与细胞内IL-1受体（interleukin 1 reptor，IL-1R）、Toll样受体及MHC II类分子等信号传递[20]。首先，SEB可与APCs上的MHC II类分子结合，提高MyD88水平，增加IL-1R I型的表达，激活下游信号组分NF-κB，促进炎性细胞因子释放[21]。研究发现，经抗MHC II类分子抗体处理后的单核细胞，对200 ng/mL SEB刺激无反应，其细胞内的MyD88水平和TNF-α基因的表达显著降低；利用200 ng/ml SEB刺激正常单核细胞发现，与对照组相比，细胞内MyD88、IL-1R相关蛋白激酶4（interleukin 1 receptor-associated kinase4，IRAK4）及TNF受体相关因子6（TNF receptor-associated Factor6，TRAF6）蛋白含量均显著上调，NF-κBp50亚基和p65亚基含量增加50%和75%，炎性细胞因子IL-1和TNF-α水平显著提高[4]。将compound 4210（抑制MyD88介导激活NF-κB）与小鼠脾细胞共同培养，经0.1 mg/mL SEB刺激产生的促炎因子显著降低[22]。因此，SEB结合MHC II类分子后，可激活MyD88，诱发MyD88/IRAK/NF-κB通路信号传导，分泌炎性细胞因子。其次，SEB-MHC II通过形成MHC II-SEB-TCR复合物，使APC细胞膜上的共刺激分子与T细胞表面共刺激受体结合，联合诱导下游信号级联反应，不仅激活磷脂酶Cγ，使质膜上磷酰肌醇水解生成（diacylglycerol，DAG），进而磷酸化PKC；也可激活（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）并募集多种磷脂肌醇至质膜，从而活化磷脂肌醇依赖性激酶1，使PKC和蛋白激酶B磷酸化[3]。PKC随后激活IKK，使IκB磷酸化并降解，释放NF-κB以进入细胞核结合靶基因，促进炎性细胞因子IL-1、IL-6及TNF-α的分泌[5]。研究发现，单核细胞与淋巴细胞加入PKC抑制剂混合培养后，用100 ng/mL SEB刺激，与对照组相比TNF-α水平显著降低；加入DAG激酶抑制剂（阻断DAG降解途径以提高细胞内DAG水平）混合培养，用10 ng/mL SEB刺激后，与对照组相比TNF-α水平提高30%[23]。可见，在SEB调控的PKC/NF-κB信号传导通路中，SEB通过激活DAG和PI3K两个信号途径活化PKC，进而促进NF-κB释放并进入细胞核调节炎性细胞因子的合成与分泌。

此外，SEB刺激产生的炎性细胞因子IL-1β（IL-1的一种）可与多种细胞的膜上受体IL-1RI结合诱发MyD88/NF-κB介导的促炎信号，从而使炎症持续存在[21]。IL-1β与IL-1RI结合，将MyD88募集至质膜并磷酸化，诱发下游信号级联反应，其中下游信号组分IRAK1激活TRAF6，活化NF-κB诱导激酶，使IKK磷酸化，激活NF-κB上调炎性细胞因子的表达，加重机体炎症反应[24]。综上所述，SEB通过上调APCs中MyD88的表达，以及激活T细胞内DAG和PI3K信号传导使PKC磷酸化，促进NF-κB的活化，分泌炎性细胞因子IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α，诱导炎症反应。由SEB刺激所产生的IL-1β还可与其受体结合，激活细胞内NF-κB介导的促炎信号，加重动物的炎症反应。

3.2 SEB对动物MAPKs通路的影响

MAPKs是蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶，由促丝裂原活化蛋白激酶激活，可将细胞外信号通过p38 MAPK、JNK或ERK等途径转化为细胞反应，如细胞增殖、分化、凋亡及分泌炎性细胞因子等[25]。用2 g/mL SEB处理巨噬细胞30 min，对细胞裂解物分析发现，p38 MAPK磷酸化水平显著提高，而不同剂量p38 MAPK抑制剂与巨噬细胞共同培养后，在2 g/mLSEB刺激下，p38 MAPK的磷酸化呈现不同程度的抑制[26]。小鼠静脉注射50 g SEB，取脾脏和淋巴结T细胞分析，结果显示c-Jun磷酸化水平显著提高，激活JNK通路[27]。0.1 g/mL SEB处理T细胞发现，ERK活性增加16.8倍，显著诱导ERK激活[28]。由此表明，SEB可激活免疫细胞MAPKs，介导信号级联反应。随后p38 MAPK、JNK和ERK进一步激活NFAT和AP-1，调控T细胞的增殖、分化、凋亡及炎性细胞因子分泌[5]。利用100 ng/mLSEB处理单核细胞5 min后发现，细胞内p38 MAPK和JNK磷酸化水平提高至正常水平的2.25倍和5倍[27]。研究发现，用15 g/kg SEB气溶胶和MK591（MAPK级联反应抑制剂）处理猴子，与对照组相比，血液T细胞增殖水平和TNF-α分泌量分别下降55%和62%[29]。用0.1 g/mLSEB分别刺激p38 MAPK途径和ERK途径被抑制的T细胞，结果显示，两种T细胞的TNF-α分泌量均减少，可见SEB激活p38 MAPK途径与ERK途径后，可有效诱导炎性细胞因子TNF-α分泌[28]。上述研究表明SEB诱导激活免疫细胞内MAPKs介导的信号级联反应，经p38 MAPK、JNK和ERK进一步激活NFAT和AP-1，调控机体免疫功能。

此外，SEB激活单核细胞、T细胞以及B细胞内MyD88介导的促炎信号后，通过活化IRAK4和TRAF6亦可激活MAPKs，诱发下游信号级联反应[21]。Gohda等研究发现[30]，缺乏TRAF6的小鼠巨噬细胞在依赖于MyD88信号传导的外源刺激下，MAPK磷酸化水平显著抑制，因此MAPK的活化可依赖于MyD88激活后TRAF6的磷酸化。但SEB激活免疫细胞内MyD88途径及下游信号级联反应（IRAK4和TRAF6），进而影响MAPKs的研究还较少，有待深入探究。综上可知，SEB直接或间接激活免疫细胞细胞内MAPKs信号级联反应，再通过p38 MAPK、JNK和ERK途径调控细胞的增殖、分化、凋亡及炎性细胞因子分泌，进而影响动物免疫系统。

4 展望

SEB主要通过激活NF-κB促炎信号通路和MAPKs信号级联反应影响动物的免疫系统：（1）SEB不仅与APCs上MHC II类分子结合，激活APCs内MyD88，还与TCR结合形成MHCⅡ-SEB-TCR复合体，激活T细胞内PKC，从而活化NF-κB并使其靶向细胞核，合成与分泌大量炎性细胞因子，引发动物机体损伤；（2）SEB亦可激活免疫细胞MAPKs信号级联反应，活化NFAT和AP-1，介导T细胞的增殖、分化与凋亡等，调控机体免疫功能。SEB还有诸多问题需要解决：SEB活化免疫细胞，除影响NF-κB和MAPKs外，还需深入探究其对机体其他信号通路的影响，如SEB对MAPKs信号级联反应下游NFAT和AP-1作用尚不明晰；SEB的现有研究主要集中于模式动物（小鼠、大鼠），对其他动物（家畜、家禽和水产动物等）的相关研究还需不断深入。