细胞游离DNA片段组学用于慢性肝病诊断的研究进展

曾伟兰 李璟 汪艳

细胞游离DNA通常指外周循环血中所有未被包裹的无细胞DNA (cfDNA)，其来源被认为是主要自凋亡或坏死细胞释出，还有一些自正常细胞生理性释出，而进入循环血的DNA片段[1]。 典型cfDNA为长度小于200碱基对(bp)、平均长度约169 bp的DNA双链片段。cfDNA不仅可以从外周血中检测，一些研究还从尿液、粪便、脑脊液、唾液、胸水和腹水中分离和分析cfDNA。近期发现DNA核酸酶和DNA片段化因子等参与了胞内cfDNA形成，但其中详细的生成和释出机制还未全面揭示[2]。通常吞噬细胞会迅速清理这些释出片段，使得健康人体生理状态下血浆中cfDNA平均浓度约在10～15 ng/mL，这些cfDNA大部分来自造血细胞，微量来自肝脏[3]。 当某组织细胞来源cfDNA异常大量出现超出吞噬能力时，会以不同碱基片段长度及其不同浓度显著出现在循环血中，并且这些指标的变化范围比较大。cfDNA是液体活检研究领域的重要组成部分，其临床应用实践目前主要在产前诊断和肿瘤学等领域。

由于无创性检测本身在筛查、早诊、随访、预后判断等方面具有比较明确的应用优势，cfDNA作为一种理论上可以反映组织学损伤及其原位机制信息的无创指标，已有大量研究工作对其生物学功能相关特征进行探索。其中，关于cfDNA片段分布特征的分析研究，如片段长度及其频率谱，被称为cfDNA片段组学。随着序列分析能力尤其是测序技术和生物信息学分析技术的飞速进步和完善丰富， cfDNA片段组学的指标和解读内容相应增加，如末端基序、首选末端、核小体印迹、锯齿末端、DNA 拓扑学、遗传和表观遗传学信息等，显示出可以为相关领域疾病诊断甚至治疗决策提供新标志物的应用潜力[4-5]。这些研究陆续发现cfDNA片段组学特征并非是随机性的，组织细胞来源、疾病进展阶段、年龄、DNA核酸酶活性，以及序列分析技术等都是影响cfDNA片段组学特征的重要因素[6- 7]。还有一些共性发现如，肿瘤细胞来源cfDNA较非肿瘤来源cfDNA的碱基数量小，胎儿来源cfDNA较母体来源cfDNA也存在此特点。

cfDNA应用研究在肝病领域已涉及多种肝病。目前报道最多的是关于在肝肿瘤诊疗预后等方面的判断能力以及对肝转移癌的诊断分析等，常见的判断指标包括各类突变类型和分布、拷贝数、甲基化特征、首选末端基序、线粒体DNA突变等，以体现肿瘤组织DNA变异特点为其理想表现[8]。 但是，基于序列突变和修饰现象本身的变异性大、含量甚微，意味着准确测量的技术挑战比较大，因此研究者又尝试应用cfDNA片段组学信息，如锯齿末端[6- 9]， 进行分析评估。最近一项前瞻性单中心研究采用全基因组测序技术，对来自192例原发性肝癌和170例无肿瘤对照组患者血浆的cfDNA片段长度及其数量进行测量，然后将这些数据转化为片段长度比率和片段分布率两类指标，以这两类指标数据作为输入变量、以该队列诊断结果为输出变量，用机器学习工具进行建模，再将此模型用于另一个分布情况类似的、含189例原发性肝癌和165例无肿瘤对照组的独立队列进行诊断能力测试，发现该模型在肝癌检出方面的总体判断表现很好(观察者曲线下面积 0.995，敏感性 96.8%，特异性98.8%)，尤其对早期原发性肝癌(在该研究队列总人数比率占70.3%～74.1%)、不大于3 cm的小肿瘤，肝细胞癌或胆管癌的敏感性很高(95.9%～100%)[10]。 总之，尽管采用各种cfDNA指标的肝肿瘤诊断方法纷纷呈现，不少甚至有突出结果，但至今就cfDNA辅助诊断对这类患者长期预后的影响仍未有确切报告。cfDNA在早期诊断肝移植相关肝损伤的应用研究也有不少研究探索。近期一些研究提出，供体来源 cfDNA 浓度持续增加可能有助于更加早期地判断急性排斥反应发生，并用于分辨移植肝急性失功是否主要源于排斥反应[11-12]； 但同期也另有研究显示，这些指标预测能力的可靠性也许比较有限[13]。

与肝肿瘤和肝移植方面的应用研究相比，cfDNA在慢性肝炎性肝病中的指标意义还存在较多未知。非酒精性脂肪性肝病/肝炎(NAFLD/NASH)已成为全球主要常见肝病。有研究回顾性分析了58例NAFLD患者和13例健康者的血样，采用实时定量PCR测量发现NAFLD组的90 bp cfDNA水平显著高于健康组，NAFLD组中的90 bp和222 bp两种cfDNA浓度变化都与该组患者的疾病活动度和疾病程度显著相关[14]。另一项研究对49例疾病进展情况包括了从NAFL到肝硬化的NAFLD患者进行了血浆cfDNA分析，指标包括总cfDNA、编码cfDNA、Alu重复序列、线粒体DNA拷贝和5甲基2‘脱氧胞苷的浓度水平；发现肝硬化较非肝硬化患者的总cfDNA水平和编码cfDNA水平显著降低，而5甲基2‘脱氧胞苷水平显著增高；且肝硬化与低水平总cfDNA和编码cfDNA之间存在独立相关性[15]。有研究对52例肝硬化急性失代偿、57例入院诊断为慢加急性肝衰竭，以及40例健康对照进行观察，发现血浆中总cfDNA水平在慢加急性肝衰竭患者高于肝硬化急性失代偿患者，器官衰竭病情严重或入院后30 d内死亡的患者中的总cfDNA水平也较高[16]。 还有研究在对乙酰氨基酚过量引起急性肝损伤的小鼠模型和患者的血浆中，发现肝细胞来源cfDNA浓度会大幅增加，该指标会随着治疗情况变化，较常规生化指标变化似乎更敏感[17]。 近期一项基于cf核小体测序策略的探索性技术研究初步显示，通过进一步获取其中转录组信息，可以辨识不同病因学的慢性肝病包括NAFLD、NASH、自身免疫性肝炎、肝移植、心源性肝损伤、部分肝切除等，甚至可以分辨出肝损伤分布的主要组织区带[18]。这类新技术也许可以进一步提高cfDNA在慢性肝炎性肝病中的应用潜力。

尽管近十年来不少概念验证性研究提示，与临床上传统使用的有创指标和基于血液分析的无创诊断指标相比，cfDNA检测在特定疾病诊疗中具有独特优势，但cfDNA在研究广泛性和应用普及性方面仍未见显著突破，对于大多数临床条件，技术实施和分析能力仍是阻碍cfDNA应用推广与普及的主要原因[19]。血样中目标cfDNA的浓度极低且易降解是技术实践困难的主要根源之一[20]。因此在每个技术环节需要详细标准化设计并严格实行[7, 20]：为尽可能减少血液细胞释放非目标cfDNA对目标cfDNA造成污染，需避免样本发生溶血，发生溶血的样本不适于用于cfDNA分析。通常条件下静脉采血后应在1～4 h内分离出血浆。如果使用含有对血细胞有稳定作用添加剂的特殊采血管，样本放存期限可以增加至7 d以上。通常应至少依次进行低速(如3000× g)和高速(如30 000 ×g)两次离心除血细胞和游离长链DNA片段。分装后-80 ℃冻存两周内使用对cfDNA的影响最小。如使用专门提取cfDNA的商业化试剂盒可以在保留短片段DNA方面有所改进。血样处理具体流程(如待处理时间、离心、温度等因素条件)不同可能会引起不同分析结果的产生。就此值得一提的是，尽管不少cfDNA应用研发报道展示了突出的诊断能力，但其中技术流程的精确性、重复性等质控基础是否充分以及是否具有可普及性，相较其数据结果，在报告中常常没有受到应有的突显。另外，在获取cfDNA之后应采取何种分析或测序技术、何种测量指标，如何解读指标结果，如何获得临床最优模型，这些也超出了临床医学目前专业教育的常规范围，跨学科交叉技能是日常实现cfDNA检测分析的必备基础条件。此外，除了实验室技术环节，研究设计也往往影响有关发现的实际临床价值，如肝癌通常发生于当地多发慢性肝病肝硬化或严重肝纤维化阶段，因此在评估肝癌识别指标时，应将这些临床情况对应设计在对照队列中，而非仅考虑将健康者作为研究对照，或对照队列中大部分为健康者。从目前来看，本领域还需要更多在技术严谨性和临床设计严谨性双方面高质量的研究报道。